活细胞成像技术观察坏死性凋亡过程中的溶酶体膜通透化

本方案描述了一种利用荧光探针进行活细胞成像的方法，用于监测坏死性凋亡过程中溶酶体膜通透性的变化，这些探针可检测溶酶体膜完整性和酸化状态的改变。该领域的挑战在于表征细胞死亡过程中细胞器损伤的动态变化，并精确界定这种损伤如何驱动或促进细胞死亡。首先，将5,000个细胞接种于含有抗生素的DMEM培养基中，每皿两毫升，置于无菌的玻璃底培养皿中。

将培养皿放入设定为37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中，过夜培养细胞。在新鲜的含抗生素DMEM培养基中加入20微升葡聚糖绿色微珠，使其稀释至每毫升含25微克。移除培养皿中的旧培养基，并替换为2毫升含牛肉提取物的补充DMEM培养基。

将培养皿放入设定为 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的培养箱中，培养 24 小时，以使微珠内化至溶酶体中。随后，在 2 毫升新鲜 DMEM 培养基中加入 2 微升 1 毫摩尔的 LysoTracker 储存液。用此染色液替换原有培养基。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育两小时。依次打开共聚焦系统的各个组件，包括开启计算机、显微镜、扫描器电源、激光电源、激光发射以及Leica电源。启动环境控制装置，包括名为Cube的温度控制器和名为Brick的二氧化碳气体混合控制器。

打开二氧化碳和氧气供应。将温度控制器设置为37摄氏度。将气体和湿度控制器设置为5%二氧化碳和95%湿度。

组装成像室。染色后，用两毫升 PBS 洗涤细胞三次，然后加入两毫升新鲜的含补充物的 DMEM 培养基。成像前在物镜上滴加浸油。

将培养皿安装在显微镜载物台上。将激光强度调节至最高3%，但不得超过5%。然后在显微镜软件中调节探测器增益以优化信号。通过调节对比度条来最小化背景。

获取未经处理的细胞的基线图像，作为对照条件。将培养板放回超净工作台，加入一毫升含有细胞死亡诱导剂的抗生素DMEM培养基。在成像软件中，将模式设置为XYT，图像格式设为512×512，扫描速度设为400，放大倍数设为3，线平均设为1，线累积设为3，帧累积设为1，时间间隔设为3分钟，总时长设为8小时，并启用自动对焦功能。

单击开始以启动延时成像。初始成像确认了LysoTracker和荧光素标记的葡聚糖存在稳定的点状结构，表明在处理前溶酶体保持完整。TSZ处理4小时后，LysoTracker荧光明显减弱，而葡聚糖开始呈现弥散的胞质分布，提示溶酶体膜通透性初始发生改变。

处理后8小时，LysoTracker的信号几乎完全消失，而许多细胞仍保留着绿色葡聚糖点状结构，并伴有弥散的绿色胞质信号。我们证明了在发生坏死性凋亡诱导的活细胞中，可以直接观察到溶酶体膜的通透化过程。本方案表明，联合使用LysoTracker和葡聚糖珠可实现实时同步监测溶酶体pH变化与内容物释放。

该活细胞成像方案的重要进展在于其能够实时监测微小的 pH 变化和溶酶体膜通透化，捕捉到诸如流式细胞术和单层染色等终点分析方法所遗漏的动态事件。