杀虫剂抗性家蝇 Musca domestica 中羧酸酯酶的功能表征

该方法有助于解决昆虫毒理学领域的一些关键问题，例如，是否所有表达的代谢解毒基因都参与了杀虫剂抗性？该技术的主要优势在于能够大量生产蛋白质，并在体外表征这些蛋白质在代谢杀虫剂中的功能。演示实验操作的将是本实验室的研究生 Xuechun Feng。

薛晨的博士研究重点是鉴定羧酸酯酶在家蝇（Musca domestica）对寄生虫产生抗性过程中的功能。首先，在250微升的PCR管中，将一微升GFP入门质粒DNA与五微升市售的C端线性DNA混合。接着，向每个PCR管中加入两微升市售的λ重组混合液。

轻轻混匀各管，于 25 摄氏度孵育过夜。将 2 毫升对数生长期的昆虫 SF9 细胞培养物均匀接种至细胞培养板的孔中。然后在生物安全柜中，于室温孵育至少 3 小时，使细胞充分贴壁。

在250倍倒置相差显微镜下观察细胞贴壁情况。随后，移除细胞培养基，并更换为2毫升Grace's昆虫培养基。之后，根据文本方案配制转染混合液A和B溶液。

然后轻轻敲击试管，将转染混合物A和B轻柔混匀。在生物安全柜中室温下孵育混合物35分钟。接着将混合物逐滴加入已接种的细胞中。

用封口膜密封各孔，并在27摄氏度下过夜培养细胞。将每孔中的2毫升Grace昆虫培养基更换为2毫升完全生长培养基。然后，向每孔中加入100微摩尔的更昔洛韦。

用封口膜密封各孔，在27摄氏度下培养细胞72小时。感染后72小时，收集每孔的培养基，转移至1.5毫升离心管中。然后在4摄氏度下以1500 × g离心5分钟。

向孔中加入一毫升完全培养基，使用带有荧光光源的显微镜观察细胞在P1杆状病毒扩增阶段的感染迹象。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，在避光条件下于4°C保存。随后，将两毫升处于对数生长期的昆虫SF9细胞培养物均匀接种于细胞培养板的各孔中。

在生物安全柜中，于室温下静置至少三小时，使细胞充分贴壁。向接种有细胞的孔中加入5微升P1病毒原液，然后每孔加入100微摩尔更昔洛韦。密封各孔，于27摄氏度培养72小时。

首先，将5毫升对数生长期的昆虫SF9细胞与完全培养基在T25未处理培养瓶中进行培养。然后，在27摄氏度下，加入25微升P1病毒原液感染细胞培养物，轻柔振荡培养48小时。使用乙腈配制100毫摩尔氯菊酯的系列稀释液。

然后，将含有感染细胞的培养物200微升加入300微升完全培养基中，接种至24孔板中。确保氯菊酯完全溶解于乙腈中，并均匀加入到板的每个孔中。加入氯菊酯后，轻轻振荡培养板，使氯菊酯在培养基中充分混匀。

此后，用封板膜密封培养板，在27摄氏度、避光条件下孵育48小时。移除培养板中的细胞培养基，注意不要扰动底部贴壁的细胞层。向每孔加入200微升的MMT试剂。

然后，将培养板置于37摄氏度孵育4小时，直至每个孔中形成深紫色的甲臜沉淀。向每孔加入500微升DMSO，以充分溶解沉淀物。随后，将200微升溶解后的溶液转移至96孔板的每个孔中。

将沉淀物完全溶解于DMSO中对结果的准确性至关重要。向孔板中的样品加入DMSO后，需使用移液器反复吹打洗涤样品数次，直至沉淀物完全溶解。最后，使用酶标仪在540纳米波长下测定孔板的吸光度值。

在P1阶段，感染率较低。在P2阶段，感染率显著提高。在P3感染阶段，几乎所有细胞均表现出从细胞培养板上脱落、细胞直径增大以及细胞生长停止等症状。

根据检测到的吸光度值，表达 Md alpha E7 的细胞相比对照组 CAT 细胞表现出显著更高的存活率。在进行该实验操作时，重要的是在细胞实验的每一步中防止细胞污染，例如在操作前使用 70% 乙醇擦拭瓶子、试管等物品的表面。完成该步骤后，还可进一步开展其他方法，如同源建模和分子对接分析，以回答更多科学问题，例如羧酸酯酶蛋白与氯菊酯配体之间的相互作用。

该技术为昆虫毒理学领域的研究人员探索昆虫杀虫剂抗性相关基因及机制的功能表征铺平了道路。请务必注意，接触杀虫剂可能具有极大危害性，因此在进行这些实验操作时，应始终采取防护措施，例如佩戴手套和穿着实验服。