通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

本实验的总体目标是将核酸递送至重要农业害虫地中海实蝇（Ceratitis Capitata）的胚胎中，从而扩展对其控制的工具箱。该方法有助于在固定生物体中对基因进行功能性校正，并可用于创制转基因品系。该技术的主要优势在于，仅需注射极少量的核酸即可实现预期效果。

将地中海实蝇种群的所有生活阶段均维持在25摄氏度、65%湿度及12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下，光照期从上午8点开始。通过笼底的小孔插入一条海绵条，利用毛细作用为果蝇提供水分。准备一个6升的饲养笼，每笼接入1,500至2,000个蛹。

对于食物，将约45克酵母与糖按1:10比例混合后装入笼中。为收集卵，将盛有水的培养皿置于笼子下方。雌虫会通过网孔产卵，卵将落入水中收集。

由于处女雌蝇可能产未受精卵，因此在收集卵之前，应等待果蝇至少一周龄，以确保所有卵均为受精卵。收集卵时，先用细筛过滤水，然后用移液管将卵转移至装有约0.5升标准幼虫培养基的塑料盒中。

如果产卵量不足，则将成虫食物中的酵母含量增加至最多25%。将每个盒子放入一个透明容器中，容器内铺有一层麦麸以利于化蛹。用网罩盖住容器，以保证空气流通。约10天后，检查是否有三龄幼虫跳入麦麸层中准备化蛹。

一旦发现，准备在接下来的几天内检查蛹。收集蛹时，使用软毛刷从容器中将其轻轻扫起。最初可将蛹收集到一个小杯子中。

收集完成后，将蛹转移到新的成虫饲养笼中。成虫大约在10天后羽化。进行显微注射前，应提前准备好载玻片。

将一条两厘米宽的双面胶带贴在载玻片上，并用陶瓷标记笔标记边缘，形成一道围挡油层的壁，以保持胚胎湿润。为收集新产的胚胎，让年轻的受精雌性果蝇在新的培养皿中产卵30分钟，然后收集胚胎。为去除胚胎的卵壳，将滤网和卵浸入商用50%次氯酸钠溶液中5秒钟。

切勿过度漂白胚胎。立即将漂白后的胚胎用滤网小心浸入洁净的超纯水中进行清洗，至少重复四次。

然后，将滤网置于洁净的超纯水中，并在两小时内完成胚胎注射。接着，使用细毛刷收集约50个胚胎，将其放置于已用水浸湿的黑色滤纸上。在体视显微镜下，将胚胎排列在预先准备好的载玻片双面胶带上。

将所有胚胎朝向同一方向排列。操作胚胎时需格外小心，因为使用毛笔刺穿胚胎膜可能会造成损伤，从而降低胚胎的存活率。现在用一层氯三氟乙烯油覆盖胚胎。

油滴应被陶瓷标记笔的边界限制，切勿溢出边界。使用微量移液器，将几微升浓度为每微升一至二微克的核酸溶液吸入注射针中。

然后，将针头连接到显微注射装置，并设置参数为在800百帕压力下注射0.5秒，回压为150百帕。注射时使用脚踏开关触发，同时利用显微操作器控制针头，并通过载物台控制装置移动载玻片。确认注射液滴正常排出后，将针头与排列中第一个胚胎的后极对齐。

移动载物台，将针头插入胚胎并注入核酸溶液。注入的液体将导致内部压力升高，从而引起胚胎轻微移动。松开脚踏板，立即但轻柔地将针头从胚胎中取出。

注射部位会有少量细胞质渗出，这是正常现象。如果胚胎在注射时发生破裂，则在将胚胎覆盖于油下之前，让胚胎干燥几分钟。

注射后，将载玻片转移至培养皿中。在培养皿盖内放置一片滤纸。用清水浸湿滤纸，然后用石蜡膜密封培养皿。

将培养皿置于25摄氏度下孵育。注射后两天，于当日多次检查载玻片，观察孵化出的幼虫。在油中寻找幼虫，并用细毛笔将其转移至含有胡萝卜基幼虫食物的培养皿中。

每个培养皿中加入不超过 200 条幼虫。幼虫在油中无法长时间存活，因此需频繁检查。将培养皿盖子大部分关闭进行幼虫培养，以保证幼虫仍有空气流通。

每天检查培养皿，一周后将培养皿放入盛有麦麸的容器中，准备收集幼虫。收集蛹，并在不久后等待其羽化。随后使用二氧化碳麻醉孵化的成虫，并检查其转化情况。

在筛选时，转移方法可能至关重要。地中海实蝇成虫可使用冰或CO2进行麻醉，但长时间暴露可能会降低其存活率。使用DS red宽波滤光片检测红色荧光的存在。

或者使用EYFP滤光片检测绿色荧光。将转化后的个体转移到含有相反性别的野生型成虫的小型饲养笼中，以建立杂合品系。在一项实验中，使用双链RNA来沉默inx5基因的表达。

未注射对照组的成体生殖系表现正常，符合预期，而处理个体则表现出发育不全的精巢和卵巢。对两性个体腹部中 inx5 转录本丰度的定量分析证实，与对照组相比，该基因的表达水平显著降低。在第二项实验中，利用β-2微管蛋白启动子驱动不同的荧光标记物，构建了两种带有标记精子的品系。

转基因雄性个体在身体和睾丸中表现出明显的荧光模式。通过本视频，我们提供了优化的地中海实蝇胚胎饲养及核酸显微注射方案。一旦掌握该技术，可在八小时工作日内完成多达 1,000 个胚胎的注射。

通过该程序，还可对其他金属如thy-lino-crisp-er、cas-min-eta-geno-meta-tine进行操作，以培育新一代的地中海实蝇品系。