心脏血管外免疫细胞的分离与鉴定
2018年8月23日
本方案介绍了一种简单高效的方法，用于在稳态或炎症状态下从小鼠心肌中分离、鉴定和定量免疫细胞。该方案结合了酶消化和机械消化，以制备单细胞悬液，并可进一步通过流式细胞术进行分析。
该方法有助于回答关于心脏内免疫细胞亚群组成在稳态和疾病状态下的关键问题。该技术的主要优势在于可用于准确鉴定心脏免疫细胞群体的免疫表型，包括极为稀有的亚群。本方案相对简单。
然而，尾静脉注射可能较为困难，因此在使用实验动物之前，务必练习该技术直至操作熟练。为了标记循环中的白细胞，将200 µL新鲜配制的PBS溶液中含荧光染料标记的抗小鼠CD45抗体加入28.5号胰岛素注射器中，并将八只12周龄小鼠置于循环水毯上预热5至10分钟，温度设置为35至41 °C。当尾静脉扩张后，将第一只动物置于合适的固定装置中，保持仰卧位固定。
如果尾静脉未充分扩张，可将尾巴浸入36至40摄氏度的水中1至2分钟。当尾静脉充分扩张后，用70%乙醇浸湿的纱布擦拭注射部位，并用食指和中指固定尾根部，用拇指和无名指固定尾部中远端。持针时使针尖斜面朝上并与静脉平行，将针头插入扩张的尾静脉，静脉内注射全部抗体体积。
随后，让抗体循环五分钟，再实施人道安乐死。取出心脏时，用70%乙醇喷洒小鼠，提起腹部皮肤，沿腹侧正中线从髋部向上至胸骨切开腹腔。切开腹膜，移开肝脏以暴露膈肌。
沿中线切开膈肌和两侧肋骨，注意避免刺破肺和心脏。将肋骨向外翻开以暴露心脏，然后切开左心房和右心房。用镊子轻轻夹住心脏基部，将连接60毫升注射器的21号针头插入心尖附近的左心室，用15至20毫升冷PBS灌注心脏。
心脏的充分灌注对于避免血管内污染物至关重要。因此，在安乐死后应迅速解剖并灌注心脏，以防止因血液凝固导致的污染。如前所述完成右心室灌注后，应观察到肺组织呈白色、肝脏呈苍白色。
用镊子轻轻夹住心脏基部，将心脏向上提起，剪断主要的肺动脉和肺静脉、主动脉以及心包膜，以分离心脏组织。用拇指和食指轻轻捏住心脏，使用干净的无绒纸巾小心擦拭清洁心脏，并用镊子去除心房以及任何残留的主要动脉、静脉或其他污染物。将清洁后的心脏置于一个5厘米的塑料培养皿中，并加入50 µL冷的PBS。
使用弯头解剖剪将心脏组织剪碎，直至无可见组织块，且组织呈均匀浓稠状。用弯头镊子将组织转移至含有800 µL冷DMEM的2 mL微量离心管中。加入胶原酶、DNase和透明质酸酶，于37°C、50 rpm条件下孵育45至60分钟。
消化结束后，将样品涡旋震荡20秒，并立即置于冰上。除非另有说明，样品应始终保存在4摄氏度，因为某些表面抗原在室温下放置时可能发生内化。然后，每份样品使用1毫升冷HBB预润湿一个140微升细胞筛，并将其放入50毫升锥形管中。
使用1毫升移液器反复吹打样品，直至组织悬液均匀且不堵塞移液器吸头，然后将匀浆后的样品加入滤膜中。每份样品用12至14毫升冰冷的HBB缓冲液缓慢冲洗，使样品通过滤膜，并将滤过的样品转移至预先标记、盛有冰的15毫升锥形管中。良好的消化效果表现为滤膜中无心脏组织残留。
通过离心收集样品并去除上清液。向每个样品中加入1毫升氯化铵钾裂解缓冲液。短暂涡旋振荡重悬样品，随后在室温下孵育5分钟。
然后加入5至8毫升冷的HBSS终止溶血。通过离心收集样品，并将沉淀重悬于1毫升荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中，转移至各自的1.5毫升微量离心管中进行另一次离心。为进行流式细胞术分析，将沉淀重悬于50微升抗CD16/CD32抗体和单核细胞阻断剂中，室温孵育15分钟，以减少非特异性抗体结合。
无需洗涤，每份样本中加入50微升抗体混合液，混匀后于4摄氏度避光孵育30分钟。孵育结束后，每管用600微升FACS缓冲液洗涤，并将沉淀重悬于300微升新鲜FACS缓冲液或1%多聚甲醛中。随后根据标准流式分析方案，通过流式细胞术分析心脏白细胞。
通过流式细胞术分析心脏单细胞悬液时，需先对 CD45 进行预设门控，以区分心脏中的免疫细胞与非免疫细胞，随后进行单细胞及小细胞排除门控。巨噬细胞通过其 CD64 表达进行鉴定，是心脏中主要的免疫细胞群体，占所有免疫细胞的 60% 至 70%。传统的心脏树突状细胞为 CD64 阴性细胞，高表达 MHC II 类分子和 CD11c。
这些细胞可根据其是否表达 CD103 或 CD11b 进一步分类，与巨噬细胞相比，其在心脏中所占的比例要小得多。通过对心肌组织的单细胞悬液进行流式细胞术分析，可研究心脏内较小的白细胞亚群。例如，通过流式细胞术分析野生型小鼠与 Batf3 缺陷型小鼠心肌免疫细胞的差异，可证实敲除型动物体内缺乏 CD103 阳性树突状细胞。
此外，该分析显示，在 Batf3 缺陷型动物中，其他心脏细胞群体的组成未发生显著改变，表明利用这种酶解与机械消化相结合的方法制备单细胞悬液所能达到的灵敏度水平。在进行该操作时，务必始终考虑所分离细胞的活性。因此，我们建议根据具体的实验条件优化消化时间和酶浓度。
采用此方法后，还可进行其他实验技术，如单细胞RNA测序、功能分析以及磁珠分离，以进一步探究所分离细胞的功能相关问题。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案介绍了一种简单高效的方法，用于分离、鉴定和定量小鼠心肌在稳态或炎症状态下的驻留免疫细胞。该方法有助于解答在稳态和疾病状态下心脏内免疫细胞亚群组成的关键问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 心脏病学
- 流式细胞术
背景
- 心脏包含多种免疫细胞群体。
- 了解这些细胞群体对心脏健康至关重要。
- 准确的免疫表型分析是研究稀有免疫亚群的必要条件。
- 尾静脉注射是标记循环白细胞的常用方法。
研究目的
- 分离并定量心肌中的免疫细胞。
- 分析不同生理状态下免疫细胞亚群。
- 改进心脏免疫应答研究技术。
使用的方法
- 通过酶消化和机械消化制备单细胞悬液。
- 利用流式细胞术分析免疫细胞群体。
- 经尾静脉注射荧光素标记的抗CD45抗体。
- 预先加温小鼠以利于尾静脉注射操作。
主要结果
- 成功从小鼠心肌组织中分离出免疫细胞。
- 鉴定出多种免疫细胞亚群。
- 证明该技术在稳态和炎症状态下均具有有效性。
- 强调熟练操作对于成功实施尾静脉注射的重要性。
结论
- 本方案提供了一种可靠的研究心脏免疫细胞的方法。
- 它有助于加深对心脏免疫应答的理解。
- 该技术经适当培训后，研究人员即可掌握。
常见问题
行业重要性概述
准确分析心脏免疫细胞亚群有助于阐明炎症通路及免疫介导的作用机制，从而在心血管靶点验证中实现基于机制的风险评估。该方法通过提供定量、可重复的免疫表型数据，提升临床前模型的预测可信度，为早期发现阶段的“推进/终止”决策提供依据。该技术解决了在稳态条件下研究稀有但功能重要的免疫细胞群体的关键空白，增强了免疫心脏病学项目的转化相关性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化心肌中的免疫细胞组成和功能区室化，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供一种可靠方法，可区分真正的组织驻留免疫信号与血管内污染，从而提高数据的完整性。
- 战略价值：通过精确定位参与心脏炎症和纤维化的巨噬细胞及树突状细胞亚群，支持靶点风险降低。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成适用于高维流式细胞术检测 panel 的标准化单细胞悬液，实现在不同实验间一致的免疫表型分析。
- 操作价值：结合酶消化与机械解离以及血管标记，获得高细胞活力和高纯度，降低检测的变异性。
- 战略价值：建立可重复的免疫细胞分离工作流程，适用于多种疾病模型和筛选研究。
转化与临床前研究
- 科学价值：支持从稳态到炎症状态的纵向免疫监测，有助于生物标志物的发现和机制研究。
- 操作价值：输出结果可兼容多种下游应用，如FACS分选、磁珠分离和单细胞RNA测序，用于功能验证。
- 战略价值：通过在相关临床前模型中确认靶点结合和免疫调节作用，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物优化的整个发现过程，提供免疫谱型数据，为心血管药物研发中的作用机制和安全性评估提供依据。
- 发现生物学：通过定量心脏中关键免疫细胞亚群（如 CD64+ 巨噬细胞和 CD11c+ MHC-IIhi 树突状细胞），支持假设验证。
- 筛选：提供可直接用于流式细胞术的单细胞悬液，实现不同遗传或药理条件下免疫组分的比较。
- 分析：生成多参数免疫表型数据（例如 CD103+ 与 CD11b+ 树突状细胞的比例），揭示特定亚群的响应特征，从而降低靶点开发风险。
- 转化研究：将免疫细胞动态变化与疾病进展相关联，支持在心脏炎症和重塑模型中进行生物标志物的比对与验证。
- 企业级复用：核心的细胞分离与标记策略可拓展至其他器官和疾病领域，促进跨平台标准化。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可靠鉴定驱动心脏病理生理学的稀有免疫细胞亚群，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的酶消化、血管标记和流式细胞术设门策略，规范免疫细胞的分离流程。
- 战略价值：提供介导免疫机制的数据，助力联合治疗方案和患者分层策略的制定，从而优化项目组合的优先级决策。
- 项目组合影响：通过在临床前药效和安全性研究中可重复地量化免疫细胞变化，支持基于风险调整的决策制定。
实施注意事项
- 需要具备小鼠操作、尾静脉注射技术和无菌组织解剖的专业知识，以确保样本质量。
- 依赖于流式细胞仪设备、荧光标记抗体以及酶试剂（胶原酶、透明质酸酶、DNA酶）的可及性。
- 需要在不同操作者之间标准化灌注、消化和裂解的时间，以尽量减少免疫细胞得率和活性的变异性。
- 需根据心脏大小、年龄和疾病状态优化酶浓度和孵育时间，以保持表位完整性。
- 受限于切除后需立即处理样本，以防止表面抗原内化并维持染色保真度。
