用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定
2018年9月20日
免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外 使用地址素包被毛细管分析抗整合素抗体、趋化因子或其他因素对人类细胞动态黏附影响的检测方法
该方法有助于回答基础免疫生物学和炎症性肠病研究中的关键问题，涉及免疫细胞归巢至外周器官所需的黏附级联反应。该技术的主要优势在于，它是一种在流动条件下解答细胞黏附相关功能问题的便捷且直接的方法。尽管该方法最初是为研究造血细胞抗整合素抗体在炎症性肠病中的作用机制而开发，但也可经修改后用于分析其他炎症性疾病环境中的类似问题。
首先，用小剪刀将一段橡胶管的一端撑开，以便将一根矩形毛细管插入约0.5厘米。然后用石蜡膜密封连接处。用20微升目标地址素（addressin）包被毛细管，并用塑料石蜡膜封住未与管路连接的一端，在37摄氏度下孵育至少1小时。
孵育结束后，移除塑料石蜡膜，将液体从毛细管中渗出至纸巾上，以排空管路。随后在37摄氏度条件下，用20 µL封闭液对毛细管进行封闭，时间至少为1小时。在去除包被后应立即对毛细管进行封闭，以避免毛细管干燥，因为干燥可能会影响编码蛋白的功能活性。
在阻塞毛细管的同时，从50毫升离心管中加入18毫升抗凝全人血，并用PBS将血液稀释至总体积为35毫升。在血液溶液下方小心铺加10毫升密度梯度介质，通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。分离结束后，将位于密度梯度介质界面处的外周血单个核细胞转移至新的50毫升离心管中。
用新鲜的PBS将离心管中的总体积补至50毫升。离心后，用10毫升新鲜PBS重悬沉淀，进行细胞计数，并根据制造商说明书使用合适的细胞示踪染料对细胞进行染色。染色孵育结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于完全RPMI培养基中，调整细胞浓度至每毫升含1.5 × 10⁶个细胞。
然后将一毫升细胞接种到48孔板中，每个处理条件对应若干个孔。加入适量体积的抗整合素抗体至相应的孔中，在37摄氏度孵育一小时。接着使用P1000移液器反复重悬细胞数次，随后将细胞转移至各个2毫升离心管中。
用一毫升 PBS 清洗每个孔，并将洗涤液收集至相应的两毫升离心管中。计数后，通过离心沉淀细胞，并将细胞重悬于适当体积的黏附缓冲液中，以获得每毫升含 1.5 × 10⁶ 个细胞的悬液。然后向每根离心管中加入适量的氯化锰，使其终浓度为一毫摩尔。
当细胞准备就绪后，打开显微镜，选择合适的滤光片和激光器、物镜以及采集模式。取下毛细管尖端的石蜡膜，用剪刀将一段五厘米长的橡胶管拉伸，以便将毛细管连接到较细的导管上。用石蜡膜密封毛细管与导管之间的连接处。
将毛细管安装到固定托盘上。将托盘放置在显微镜的托盘架上，使毛细管处于焦点位置。并将橡胶管插入蠕动泵对应的凹槽中。
将管路的未连接端放入含有细胞悬液的第一个样品管中，同时将帽端毛细管另一侧的短管插入一个15毫升离心管中以收集流出液。以500微升/分钟的流速让管路充满液体，直至细胞悬液接近毛细管位置。
然后以每分钟100微升的流速让毛细管充满液体。当毛细管中充满细胞后，将流速调整为每分钟10微升，并以每2秒一次的频率，连续3分钟拍摄细胞沿毛细管内壁缓慢移动的延时图像，该内壁已包被地址素（addressin）。一旦细胞悬液进入毛细管内部，必须避免任何流动中断，因为这可能导致整合素与地址素之间的静态相互作用，从而影响测量结果的准确性。
丢弃前，通过显微镜目镜观察整个毛细管，确保屏幕上观察到的切片具有代表性。将管路从泵上取下，让剩余液体回流至2 mL离心管中。然后将毛细管和管路从固定装置上拆下，并按照刚刚演示的方法对下一个毛细管进行成像。
为了评估延时录像，使用相应的分析软件打开第一个序列，并将前三个和后三个图像导出为 TIFF 文件。在 ImageJ 中打开前三个图像，选择图像、类型、32 位，将图像转换为 32 位。然后选择图像、颜色、合并通道，将图像合并为一幅图像，并将合成图像转换为 RGB 模式，以便保存为 TIFF 文件。
以相同方式处理最后三幅图像后，统计起始和结束时的复合图像中可见的白细胞数量，并用结束图像中的白细胞数减去起始图像中的白细胞数。当存在三种归巢受体（ICAM-1、VCAM-1 或 MAdCAM-1）之一时，用人外周血单个核细胞（PBMCs）灌注包被了 ICAM-1、VCAM-1 或 MAdCAM-1 的毛细血管，会导致显著的细胞黏附；而使用同型 IgG Fc 融合蛋白则不会引起明显黏附。
相比之下，使用中和抗体抑制整合素与归巢受体的相互作用通常会显著降低动态黏附，而加入同型对照抗体时则无此效应。此外，用特定趋化因子处理人CD4+ T细胞后，其对归巢受体的黏附能力较未经处理的人细胞增强。在进行该实验操作时，必须牢记体内多种因素共同影响动态细胞黏附，而本实验体系无法完全模拟这些体内条件。
然而，可以调整该检测方法以解决非常复杂的问题。为了进一步研究待测细胞类型的差异性黏附行为，还可以使用不同细胞示踪染料标记的不同细胞类型进行竞争性黏附实验。该技术建立后，使我们能够探索目前用于或正在开发用于治疗炎症性肠病的不同抗整合素抗体的作用效果。
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概述
本文介绍了一种功能性体外实验方案，用于分析免疫细胞与血管壁之间的动态黏附，该过程对肠道归巢至关重要。该方法能够在流动条件下分析抗整合素抗体、趋化因子及其他因素对人类细胞黏附的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫生物学
- 炎症性肠病研究
- 细胞黏附机制
背景
- 动态黏附对于免疫细胞归巢至关重要。
- 该方法可解决免疫生物学中的关键问题。
- 该技术可适用于多种炎症性疾病的实验环境。
- 理解黏附级联过程对制定治疗策略具有重要意义。
研究目的
- 探讨抗整合素抗体对细胞黏附的影响。
- 提供一种简便的功能分析方法。
- 促进在流动条件下免疫细胞行为的研究。
使用的方法
- 拉伸橡胶管以插入毛细管。
- 用寻址素包被毛细管。
- 在37摄氏度下孵育。
- 用石蜡膜密封连接处。
主要结果
- 该方法可有效分析细胞黏附动力学。
- 它有助于揭示趋化因子和抗体的作用。
- 研究结果可为炎症性疾病的治疗策略提供依据。
结论
- 该技术是免疫生物学研究中的重要工具。
- 该方法可针对多种炎症状态进行调整。
- 了解黏附机制有助于开发更有效的治疗方法。
常见问题
行业重要性概述
在流动条件下对免疫细胞黏附功能的分析对于评估炎症性肠病中抗黏附疗法至关重要。该动态黏附检测提供了一种符合生理相关性的系统，可用于评估整合素抑制剂的作用靶点结合情况及作用机制。该方法可在体内试验前实现治疗候选物的定量比较，从而支持早期阶段的风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在剪切应力条件下研究整合素依赖性黏附机制，从而验证靶点在炎症性肠病（IBD）发病机制中的相关性。
- 操作价值：提供可重复的功能性检测读数，用于对维多珠单抗等抗整合素抗体及新型候选药物进行功能筛选。
- 预测价值：通过将抗体治疗与特定流动条件下黏附减少的效应关联，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过比较细胞在流经地址素包被的毛细管前后数量的变化，生成定量的黏附参数。
- 操作价值：采用标准化的灌注参数（10 µL/min 流速，3 分钟捕获时间），确保动态黏附测量结果具有可重复性。
- 检测适用性：可通过使用不同标记的细胞类型进行竞争性黏附检测，实现多重检测，便于比较治疗效果。
转化与临床前研究
- 科学价值：利用原代外周血单个核细胞（PBMCs）和生理相关的地址素（ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1）模拟人类免疫细胞归巢动态。
- 转化连续性：连接体外靶点调控与离体功能结果，可预测组织特异性免疫细胞募集。
- 临床前应用价值：支持对中和抗体进行剂量-反应分析，为候选药物优化和生物标志物策略提供依据。
流程与工作流整合
该检测适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，可提供功能性黏附数据，为抗黏附候选分子的推进或终止决策提供依据。
- 发现生物学：支持在流动条件下对整合素阻断作用于细胞黏附的假设验证，阐明治疗性抗体的作用机制。
- 筛选：提供基于灌注的定量黏附输出结果，可实现不同抗体候选物及趋化因子调控条件之间的比较。
- 分析：采用延时成像和细胞计数方法，生成减法黏附评分（终末细胞数减去起始细胞数）作为功能性终点指标。
- 转化研究：使用人外周血单个核细胞（PBMCs）和疾病相关地址素，提高对炎症性肠病（IBD）特异性免疫细胞迁移的预测可靠性。
- 企业级复用：可适应用于其他炎症性疾病模型和细胞类型，支持在免疫学研究组合中跨平台重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接、实时可视化黏附抑制过程，减少抗整合素抗体功能的机制模糊性。
- 操作价值：标准化样本制备、灌注和成像步骤，提高不同实验室和项目间的可重复性。
- 战略价值：在开展成本较高的体内研究之前，通过验证功能性靶点结合，实现更早、更有信心的决策判断。
- 项目组合影响：基于定量的、与机制关联的功能数据，支持对调节黏附的治疗药物进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞分离、灌注显微镜和延时成像分析方面的专业知识，以实现准确的黏附定量。
- 依赖于专用仪器设备，包括配备流动腔室的显微镜、蠕动泵以及37°C环境控制装置。
- 必须对地址素包被、封闭和灌注方案进行标准化，以尽量减少黏附检测结果的变异性。
- 需考虑生理复杂性的局限性；该检测方法简化了体内黏附级联过程，可能无法捕捉所有相关影响因素。
- 若需应用于其他细胞类型或地址素，必须重新优化细胞浓度、流速和孵育时间。
