一种利用RGD功能化亲和素-生物素连接臂研究血小板迁移的体外实验方法

血小板在血管损伤后防止失血、抵抗感染以及维持炎症期间的血管完整性方面起着关键作用。虽然止血栓的形成依赖于血小板的集体活化和聚集，但其在保护受炎症影响的血管中的作用则是在单细胞水平上完成的。在此背景下，近期研究发现，血小板能够自主迁移，这一过程依赖于其对黏附微环境的机械感知能力。

该方法能够精确控制底物的黏附特性，并可作为一种简单的体外实验手段，用于研究血小板迁移的潜在机制。结果表明，迁移中的血小板在结合整合素配体时可施加足以破坏亲和素-生物素键的力。该实验方法为观察血小板迁移提供了一种简单且可靠的可视化手段。

结合活细胞成像技术，将有助于我们更深入地理解不同细胞骨架组分在此重要血小板功能中的相互作用与调控机制。首先，将玻璃盖玻片在20%硝酸中进行超声处理1分钟，随后依次在异丙醇、乙醇和水中各超声处理1分钟。将预清洁的盖玻片在等离子清洗仪中用氧气等离子体处理2分钟，然后与粘性载玻片组装。

现在将 2.5 微升 PLL-PEG-biotin 用 97.5 微升 PLL-PEG 稀释后加入通道中，室温孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。接着加入 100 微升 neutravidin-FITC，室温避光孵育 30 分钟，再用 PBS 洗涤三次。最后加入 100 微升 cyclo-RGD biotin，室温孵育 30 分钟，再次用 PBS 洗涤三次。

在麻醉小鼠并去除胸部皮肤后，将针头插入胸骨左侧第二与第三肋骨之间，从心脏采血。将血液与1毫升Tyrode's缓冲液混合，在室温下以70 ×g离心20分钟（关闭刹车），然后收集含有富血小板血浆的上层液体。将其与3毫升Tyrode's缓冲液混合，并加入100 纳克/毫升前列环素以防止血小板活化。

随后，在室温下以1200 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于500 µL Tyrode缓冲液中。然后，使用血细胞计数板测定血小板数量。

首先，将小鼠血小板置于生物素-亲和素-生物素-cRGD包被的通道中，使用配备载物台培养箱的倒置显微镜记录活体血小板的迁移过程。为统计血小板黏附或迁移数量，可在工具栏中右键单击点工具的下拉菜单，选择多点工具。通过测量中性亲和素-FITC包被上所标记的迁移路径长度，从固定样本中提取迁移距离。

右键单击工具栏中直线工具的下拉菜单，选择自由手绘线工具。为量化血小板形态，选择工具栏中的“图像”、“调整”和“阈值”，通过分割荧光标记的血小板生成二值化掩膜。在“分析”中选择“设置测量”，勾选形态学描述符，然后通过“分析”中的“分析颗粒”选择“显示结果”。

在2.5% PLL-PEG-生物素浓度下，血小板表现出最佳的迁移能力。在较低和较高配体密度下，迁移均有所减少。在1%配体密度下，血小板铺展不充分，表现为面积和周长较小，提示整合素激活不足。

在2.5%配体密度下，血小板有效铺展，破坏cRGD配体并发生迁移。高配体密度导致血小板铺展但无极化，因无法断裂cRGD配体而减少迁移。