利用石英振荡器通过耗散型微重力测定法研究磷脂结合蛋白Annexin A2与固相支撑脂双层的结合动力学

该方法可用于研究蛋白质与脂质膜之间的作用方向。在本例中，可利用该方法分析钙离子依赖性的膜联蛋白与带负电荷的磷脂之间的结合。该技术的主要优势在于无需标记、灵敏度高、具有定量性，并且能够实时观察相互作用过程。

从而实现对真实结果的直接分析。该技术还可应用于其他体系，例如更复杂的微分子组装体甚至细胞之间的相互作用。使用文中实验方案所述的清晰的5 mM脂质溶液。

将溶解的脂质按所需摩尔比例在10毫升玻璃试管中混合。使用干燥的氮气流蒸发有机溶剂。将脂质混合物置于高真空冷冻干燥系统中三小时，以去除溶剂的任何残留痕迹。

现在，将脂质膜重悬于1毫升柠檬酸盐缓冲液中。将脂质悬液置于水浴中，在60°C下孵育30分钟，每5分钟剧烈涡旋振荡一次。该温度比混合物中熔点最高脂质的相变温度高出约10°C。

同时，将配备有孔径为50纳米聚碳酸酯膜的挤出器预热至相变温度以上30分钟。将多层囊泡悬浮液加入预热的挤出器中。缓慢地将混合物通过聚碳酸酯膜挤出31次，以形成小单层囊泡（SUVs）。

保持温度高于相变温度。将 SUV 悬液转移至一个 2 毫升的塑料反应容器中，并加入柠檬酸盐缓冲液，使最终体积达到 2 毫升。将插入聚四氟乙烯支架中的四个传感器置于 2% SDS 溶液中孵育至少 30 分钟。

然后用超纯水彻底清洗，以完全去除SDS，并使用干燥的氩气或氮气流吹干。使用等离子清洗系统彻底去除任何污染物。具体操作为：将干燥的传感器放入等离子清洗腔室，抽真空后用氧气冲洗三次。

然后，打开等离子清洗机。使用真空、高射频功率，处理时间为10分钟。清洗程序结束后，关闭设备并取出传感器。

使用镊子小心地将经过等离子清洗的传感器插入四个流体室中。避免对流体室和管路施加任何压力或扭转，以防发生泄漏。在开放流模式下用柠檬酸盐缓冲液冲洗系统10分钟。

启动程序。使用软件开始记录基频及各高次谐波的频率和耗散变化，直至频率和耗散基线稳定。当基线稳定后，在柠檬酸盐缓冲液中加入SUV悬液。

使用反应容器，移除1.5毫升的死体积，然后在循环流动模式下关闭系统。再记录10分钟的频率耗散变化。当SLB稳定后，在开放流动模式下用含有所需钙离子浓度的运行缓冲液平衡系统40分钟。

将蛋白质加入含有钙的运行缓冲液中。以循环流动模式上样蛋白质，直至达到平衡稳态。随后，在开放流动模式下，于运行缓冲液中加入5毫摩尔的EGTA螯合钙离子，使已结合的蛋白质解离。

以连续开放流动模式，用 50 毫升双蒸水再生微量天平系统。将管路从水容器中取出，让系统运行至干燥。小心取出晶体传感器，并使用聚四氟乙烯支架，用 2% SDS 溶液清洗。

干燥传感器放置位置处流路模块内部的可见部分。图中显示的是频率曲线和耗散变化的记录。加入脂质体后频率显著下降，表明脂质体已被吸附；由于缓冲液填充的囊泡并非刚性结构，而是具有粘弹性，因此耗散值上升。

随后，融合的囊泡发生破裂。囊泡内缓冲液的同步释放导致吸附质量下降，直至达到稳定平台期。膜联蛋白A2与脂质的结合增加了质量，这通过明显的频率偏移得以体现；但该结合并未干扰双层结构，因为耗散值仅发生微小变化。

当螯合剂 EGTA 去除钙离子后，膜联蛋白 A2 会从脂质膜上解离。频率和耗散信号的变化恢复至仅存在双层脂膜时的水平，表明膜联蛋白 A2 的结合完全依赖于钙离子，且脂质膜保持完整。此处展示了一个典型的阴性对照实验结果。

当不存在磷脂酰丝氨酸时，在钙离子存在下加入膜联蛋白A2后，频率和耗散均无明显变化。进行该操作时，必须确保双层膜的正确形成。脂质体应立即使用，否则小囊泡会融合成更大的囊泡，表面张力降低，可能导致基线不稳定。

通过该实验步骤，可对膜蛋白相互作用进行定量描述，从而回答其他问题，例如协同性结合与非协同性结合之间的差异。