使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

蛋白质在复杂的构象空间中发挥作用，其中大部分状态是隐藏的。我们利用单分子成像技术来揭示这些状态。在脂质双分子层中追踪单个膜蛋白时，主要挑战在于样品制备、光漂白以及时间分辨率。

首先，将脂质柄溶液从冷冻室中取出，使其升至室温。从烘箱中取出一个洁净的10毫升烧瓶，待其冷却至室温。向冷却后的圆底烧瓶中加入900微升光谱纯氯仿和100微升光谱纯甲醇。

然后向烧瓶中加入适量的每种脂质，并轻轻旋转以充分混匀。现在将真空蒸馏接头置于圆底烧瓶上方，并将其连接至氮气干燥管线。接着打开氮气，调节压力，直至在手背处 barely 感觉到气流即可。

每5微摩尔总脂质加入1毫升缓冲液至圆底烧瓶中。在烧瓶上放置玻璃塞，并用石蜡膜密封。将烧瓶用夹子固定于铁架台上，将其底部浸入60 °C的超声水浴中。

确认溶液变为不透明，且烧瓶内壁无脂质残留。孵育一小时后，开启超声仪，并将振幅调至最高。在水浴中移动烧瓶，寻找振荡最强的位置，此时可观察到溶液在烧瓶内明显跳动并喷溅。

将溶液超声处理30分钟。观察溶液从不透明变为透明且略带乳光的过程。从烧瓶中取出脂质溶液，并转移至微量离心管中。

在4°C条件下，以100,000 G离心1小时。离心后，移去上清液并转移至新的离心管中。将25毫米石英盖玻片放入烧杯中，加入等体积的纳米纯水、30%过氧化氢和浓硝酸。

将盖玻片放入已配制好的溶液中加热 30 分钟，直至开始产生气泡。每 10 分钟检查一次溶液，并轻轻摇晃，以防止盖玻片相互粘连。观察盖玻片在摇晃过程中逐渐滑动并分离。

分离后，逐渐降低旋转速度以维持其分离状态，并使产生气泡的溶液均匀覆盖在盖玻片表面。随后，在轻轻旋转的同时用纯水彻底冲洗盖玻片，以去除所有化学残留物。或者，可依次使用正己烷和甲醇清洗石英盖玻片，并用镜头纸擦拭，每种溶剂使用后更换新的镜头纸。

将盖玻片放入紫外臭氧清洗仪中，待处理面朝向光源。以每平方英寸五磅的压力向腔室内通入氧气，持续五分钟。随后关闭氧气流。

现在打开紫外灯照射15分钟，然后让盖玻片静置至少10分钟，以使臭氧消散。将一块新清洁的盖玻片放入25毫米的样品托中。使用1/4英寸SM1镜头套管，切割一个直径为8毫米的双层Parafilm垫片，并将其置于样品托的中央。

将50微升的小型单层脂质体液滴加到8毫米垫圈的中心。密封腔室后，在37°C下孵育一小时。孵育结束后，用移液器冲洗去除溶液。

向双层膜中加入 50 µL 新鲜缓冲液，重复此过程共 10 次。最后一次冲洗后，从样品槽中移除缓冲液。加入 50 µL 含去垢剂的目标蛋白质等分试样，确保其浓度等于或低于临界胶束浓度。

将样品在37摄氏度下孵育至少一小时，以使蛋白质充分结合，随后用缓冲液冲洗样品，去除未结合的蛋白质和去污剂。将垂直像素移位速度设置为约600纳秒，并使用超频模式提高垂直时钟电压。然后将水平像素读出速度配置为最大值。

将前置放大器增益调节至2。将放大器输出设置为电子倍增模式，并将电子倍增增益调至最高水平。然后将曝光时间设置为25毫秒。

确认实际帧率略高于曝光时间。然后调节激光功率，直至信号明显高于背景噪声。采集足够的成像数据，以获得每样本至少1000条轨迹。

进行追踪分析时，将所有数据集裁剪为统一尺寸，并使用 Image J 进行背景校正。在 Fiji 中，将需要分析的视频或堆栈 TIFF 文件拖放到界面中。要输入像素标定信息，请转到“分析”选项卡，选择“设置标尺”，并应用针对该仪器的像素到距离的标定参数。然后保存一份数据集副本，以保留原始数据并记录所做的任何更改。

从选定的感兴趣区域中减去背景，并将其应用于原始数据的保存副本。转到“处理”选项卡，选择“减去背景”。在“插件”选项卡中，依次选择“跟踪”和“TrackMate”，以启动用于跟踪分析的 TrackMate 对话窗口。

使用紫外-可见光谱法计算出AQP4四聚体的标记度为4.12，泊松分布分析表明98%的四聚体至少携带一个荧光染料分子。直方图显示步长分布较广，与不同大小的正交颗粒阵列的扩散行为一致，计算得到的平均扩散系数为0.0143平方微米每秒。在本视频中，我们鉴定了对水通道蛋白4调控至关重要的关键状态及其相关的热力学作用力。

本方案消除了构建含纯化跨膜蛋白的仿生膜时的经验性猜测，适用于延时单分子示踪。在拐点处运行的蛋白质机器，通过延时单蛋白追踪可直接观察其随机路径、分支及终止状态。