一种通过基因组编辑在Drosophila中高效构建组织特异性双元转录系统的方法

本方法的总体目标是构建一种高度组织特异性的靶向表达系统。在本方法中，我们展示了针对果蝇 FGF 同源基因 branchless 构建的二元转录驱动系统的生成。branchless 的动态时空表达调控气管上皮的分支造血过程。

尽管该方法可揭示无分支细胞的时空表达与迁移过程，但它也可轻松应用于果蝇或其他模式生物（如秀丽隐杆线虫和斑马鱼）中的其他基因和组织。该技术的主要优势在于，它所构建的表达系统具有高度可靠性，且具有组织和基因特异性，仅在被替换基因的顺式调控元件具有功能的细胞中激活。双组分转录系统是实现靶向基因表达与操控的关键工具。

一种转录激活因子（如GAL4或LexA），在基因的顺式调控元件控制下表达，可驱动位于特定转录结合位点下游的效应转基因的表达，例如GAL4对应的UAS或LexA对应的LexO。该方法将branchless基因的第一个编码外显子替换为转录驱动元件。基于CRISPR Cas9的技术将LexA转录激活因子序列置于branchless基因内源性调控元件的控制之下，从而仅在branchless基因特异的空间和时间表达模式中启动转录激活因子的表达。

首先选择两个特异性靶向目标区域两端的向导RNA靶位点。打开所选的CRISPR设计工具，此处使用的是Fly CRISPR Optimal Target Finder。

单击“选择基因组”，插入目标序列，在下拉菜单中选择最新上传的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）基因组注释版本，当前为 R_6。接着，单击“选择引导序列长度”，输入 20。选择“所有 CRISPR 靶点”，然后单击“查找 CRISPR 靶点”。

通过将严格性设为最高，并将PAM限定为NGG，评估所有候选的向导RNA靶点。为构建串联向导RNA表达载体，首先通过PCR扩增一段DNA片段，将两个前间隔序列引入pCFD4 RNA表达载体骨架中。使用一对引物（正向和反向引物），每个引物包含一个前间隔序列，并与pCFD4载体序列重叠，以高保真聚合酶和pCFD4模板DNA进行PCR扩增。

为进行克隆，需用 Bbs1 酶消化 pCFD4 质粒。在适当的消化缓冲液中设置反应体系，包含 2 至 5 微克的 pCFD4 质粒和 1 微升的 Bbs1 酶，最终体积为 50 微升。通过轻轻敲击管壁混匀反应液，并短暂离心使管壁上的液滴全部收集至管底。

在琼脂糖凝胶电泳跑完PCR产物和酶切质粒后，将反应体系在37摄氏度下孵育两小时。使用标准的凝胶纯化柱纯化6.4千碱基对的线性质粒和600碱基对的PCR产物。按照制造商的说明书设置DNA组装反应。

对于GAL4或LexA序列的基因组敲入，设计一个包含转录激活因子序列的双链HDR供体，该序列两侧带有两个同源臂。为避免向工程化位点重新靶向引导RNA，应设计替换型供体，使外源序列的插入破坏引导RNA的识别位点。此外，为避免改变顺式调控元件的完整性，应始终选择位于编码外显子区域内的引导RNA识别位点。

为了构建替换片段，需设计DNA组装策略，将四个片段连接在一起：5'端和3'端同源臂、中间的外源转录激活因子DNA序列，以及线性化的克隆载体骨架。从合适的载体中PCR扩增GAL4或LexA表达盒，并从选定用于注射的亲本果蝇品系提取的基因组DNA中PCR扩增同源臂。

每次 PCR 反应中均使用高保真聚合酶以扩增目标片段。进行 DNA 组装反应时，按照生产商说明书，将线性化的克隆载体、PCR 克隆获得的目标片段与 DNA 组装预混液混合，最终反应体积为 20 微升。将反应混合物在 50 摄氏度下孵育 1 小时。

当先前注射了引导RNA表达质粒和替换供体质粒的Nos-Cas9胚胎发育为成虫后，将每只G0代果蝇与适用于目标等位基因的平衡品系果蝇进行单对杂交。用二氧化碳垫麻醉每对G0杂交产生的F1后代，在体视显微镜下随机挑选10至20只雄性个体。

将每只选定的雄蝇与适用于目标等位基因品系的平衡染色体雌蝇进行单独杂交。当F2代幼虫孵化后，挑取每对杂交组合中的F1代父本。用移液器吸头吸取50微升裂解缓冲液（不排出缓冲液），对每只果蝇挤压10至15秒，以提取基因组DNA。

然后，将剩余的缓冲液加入管中并充分混匀。在37摄氏度孵育20至30分钟。孵育结束后，将试管置于95摄氏度的加热块中加热1至2分钟，以灭活蛋白酶K。在10,000 ×g离心5分钟后，将样品在4摄氏度保存，用于后续PCR分析。

使用引物正向一和反向一进行三步PCR筛选，以检测插入或替换的存在。使用正向二和反向二引物进行PCR，以验证来自3'区域的插入或替换。使用引物M13F和反向三进行PCR，以检测末端同源定向修复（ends-in'HDR）。

保留经确认发生末端外切同源定向修复（ends-out HDR）的果蝇品系，并从F2代建立平衡品系。再次将平衡染色体果蝇与野生型杂交，以去除其他染色体上可能存在的非预期突变。此处显示的是三龄幼虫翅盘中呈红色的支细less（branchless，bnl）表达，以及在正在发育的气囊原基中呈绿色表达的受体breathless阳性细胞。

此处显示的无分支表达细胞位于TR5横连分支和TR2背部分支中。表达Breathless的气管细胞以绿色显示。表达Breathless的细胞呈绿色，标记从9期到14期发育中的胚胎气管，而表达branchless的细胞呈红色。

该图像显示了在低氧条件下，相对于对照组，在异位组织位置诱导出的无分支（branchless）表达。该方法旨在保留 branchless 基因转录原有的全部时空调控特性。因此，仅用 LexA 转录激活因子编码序列替换该基因的第一个编码外显子至关重要。

该新型基因工具集开发完成后，为研究branchless基因在组织中的新表达模式铺平了道路。它还能够在branchless表达细胞中特异性地实现基因的异位表达和敲低，并有助于监测这些细胞的直线迁移及信号相互作用。