用于表征蛋白质基水凝胶的力钳流变术

该技术的主要优势在于其采用了一种PID（比例-积分-微分）系统，可对蛋白质水凝胶样品施加受控的力作用程序，并且仅需使用少量样品。力钳制协议使得数据的解读更加直接明了，而低样品用量在处理那些难以大量制备、仅能获得微量的蛋白质时尤为关键。该技术的应用前景包括利用蛋白质特有的折叠-再折叠转变特性，来开发和表征具有持久弹性的新型生物材料。

该方法可通过一次拉伸测量数十亿个蛋白质分子，并模拟生物组织特有的拥挤环境，从而解答组织和生物材料力学领域的问题。首先按照文本方案中的描述准备试剂溶液。要合成基于蛋白质的水凝胶，首先将一根23号针头固定在装有压紧活塞的1毫升注射器上。

然后，使用剃刀切割一段10厘米长的聚四氟乙烯（PTFE）管。将针头和注射器连接到PTFE管的一端。将管的另一端插入硅烷溶液中，并通过回拉注射器活塞使管内充满溶液。

将试管静置约30分钟。然后，移除硅烷溶液，并用压缩空气干燥试管。接着，在1.5毫升离心管中，按照恒定的体积比混合蛋白溶液、APS和三（联吡啶）合钌(II)氯化物。

将光敏溶液涡旋振荡至完全混合。然后以最高速度离心，以去除溶液中的任何气泡。在将水凝胶光敏混合物装入聚四氟乙烯管时可能产生气泡，从而导致样品损坏。

为防止气泡产生，在加样过程中应保持聚四氟乙烯管末端浸没于溶液混合物中，并缓慢回抽注射器活塞。将经过处理的聚四氟乙烯管开口端插入光敏混合物中，通过回抽注射器活塞将溶液吸入管内。随后，将装有溶液的管子置于距离100瓦汞灯约10厘米处，以避免加热，并在室温下保持最多30分钟。

将管子从针头取下，用剃刀片在靠近水凝胶末端的位置切去管子的边缘。然后使用钝化的24号针头将水凝胶挤入Tris溶液中。目视检查凝胶是否存在挤出过程中或因气泡导致的任何缺陷，并丢弃有缺陷的凝胶。

启动仪器控制程序并打开音圈电机。然后，将线圈位置设置为接近量程末端的数值。在Z方向上移动挂钩，并在X方向上对弯折处进行对齐。

然后，记录 X 方向千分尺螺丝的读数。现在，在缝合线末端打一个松散的双半结，使环的直径约为四毫米。接着，将环从线上剪下。

重复操作形成第二个环。然后，将两个环套在连接至力传感器的挂钩上。用医用镊子将水凝胶样品转移至已充满Tris缓冲液的实验腔室中。

将音圈和力传感器的挂钩置于接近溶液表面的位置，并使用 XYZ 定位操纵器在各个方向上对齐挂钩。使用医用镊子，将蛋白水凝胶样品的两端分别悬挂在连接至音圈和力传感器的挂钩上。常见的错误是在固定过程中缝合环过度收紧，导致水凝胶样品受力过大。

这可能导致水凝胶样品产生缺口并被切断。用医用镊子夹住缝合线环的两端，同时拉动，小心地将一个缝合线环固定在音圈钩上的水凝胶样品周围。对连接到力传感器的线环重复此步骤。

收紧每个钩子弯曲处的缝合线环，以防止任何滑动。利用这些弯曲处作为参考点，找到钩子之间的零间距位置。使用医用剪刀剪去缝合线多余的长度。

使用Z轴操纵器沿Z轴方向移动连接的水凝胶，将其浸入实验腔室中的实验溶液中。利用操纵器在YZ方向上对准水凝胶样品，使凝胶不受任何应力。将力传感器归零，然后通过X轴微米级位移平台分离两个钩子，直至凝胶开始受力。

发生这种情况后，将测微螺杆在 X 方向上略微回转。记录音圈电机和传感器两个操纵器的位置。然后，利用这些数值与先前测得的数值之间的差值，计算实验开始时系留钩之间的精确间距。

通过以所需的加载速率增加力来执行力- ramp 循环，输入起始力和最终力值，以及该协议的持续时间，其力-时间曲线呈倒V形，随后施加约200秒的恒定低力，以使蛋白质结构域在下一个循环前重新折叠。通过施加30秒的低力来执行恒力协议；然后将力增加至某一恒定力并维持一段确定的时间，随后将力骤降至相同的低力值并持续超过300秒，以使蛋白质结构域重新折叠并恢复凝胶的弹性。

最后，按照文本方案中所述进行数据分析。每次测量均以一条松弛曲线开始。通过拟合两条直线，确定传感器上的零力和凝胶的实际长度。

真实凝胶长度通过拟合曲线的交点以及千分尺螺丝的位置计算得出。力钳流变系统可施加两种不同类型的协议。在力递增模式下，水凝胶样品所经历的力随时间变化的协议呈倒V形。在恒定力模式下，施加的应力呈阶跃式变化。

在测量过程中，PID 系统通过改变线圈位置来调节水凝胶的伸长量，以跟随力协议中预设的目标值。应变通过将测得的伸长量除以水凝胶的实际长度来计算。应力则通过将施加的力除以水凝胶样品的横截面积来确定。

力斜坡曲线最好以应力相对于应变的形式表示。杨氏模量可通过加载阶段的斜率测量值计算得到。滞后现象反映了蛋白质去折叠和再折叠过程中产生的能量耗散。

恒定力迹线最好表示为时间的函数。可通过拟合双指数函数，利用应变的变化来测量展开和折叠速率。在尝试此操作时，需注意在加入蛋白质之前，应将管内残留的硅烷充分干燥；将蛋白质混合物离心以去除气泡；在将蛋白质混合物注入管内后检查是否存在气泡；挤出过程中如有机械损伤的水凝胶，应予以弃用。

通常，初次使用该方法的研究人员在用外科缝合线将凝胶固定到挂钩上时，最初会遇到困难，容易对水凝胶样品造成损伤。此外，将凝胶从管中推出的过程也可能损坏水凝胶。该方法可实现对小体积水凝胶样品施加恒定力的实验方案。

这些实验能够分离弹性与黏弹性行为，并以整体方法研究蛋白质的去折叠与折叠力学。该技术发展之后，材料科学领域的研究人员得以探索新型软性生物材料，例如基于工程化多聚蛋白的水凝胶，这类材料在用作组织工程支架、药物递送系统以及3D打印用生物墨水方面具有巨大潜力。该方法不仅有助于深入理解基于蛋白质的水凝胶的力学特性，还可应用于其他体系，例如测量肌纤维的等长响应或皮肤等组织的弹性。