利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

本实验的总体目标是制备用于二维牵引力显微镜研究的微图案水凝胶。首先制备甲基丙烯酸化玻璃盖玻片，并在其上形成聚丙烯酰胺水凝胶的第一层；第二步是制备另一层含有荧光微珠的水凝胶，用于牵引力显微镜分析。

将带有微图案的盖玻片置于水凝胶上方，使微图案基质蛋白转移到水凝胶表面。接着，将聚丙烯酰胺水凝胶在室温下静置聚合45分钟。然后小心移除上方的盖玻片。

荧光显微成像用于显示微珠的存在以及微图案化细胞外基质蛋白的成功转移。该方法通过光诱导细胞释放，能够高效且精确地测量细胞牵引力，从而可从同一样本中获得更多的实验观测数据。

演示该实验步骤的是我实验室的研究生Joel Christian。向烧杯中加入10毫升双蒸水。随后，向溶液中加入18.75毫升乙酸、18.75毫升3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯以及252.5毫升乙醇。

当溶液配制完成后，将其转移至结晶皿中。取24毫米圆形盖玻片，用精密擦拭纸清洁后放入定制的聚四氟乙烯架中。然后将架子浸入溶液中，孵育15分钟。

取下架子，用乙醇冲洗。在气流下干燥盖玻片。甲基丙烯酸酯化盖玻片可在室温下保存长达一个月。

取一个15毫米的圆形盖玻片，将其放置在培养皿中。使用金刚石笔在盖玻片的上表面做标记。随后通过氧等离子体处理进行清洁。

在0.4毫巴和200瓦条件下处理两分钟，使盖玻片清洁。用移液器将100微升0.01%的多聚-L-赖氨酸溶液滴加到盖玻片表面，在室温下孵育30分钟。随后，用pH为8.5的10毫摩尔HEPES缓冲液洗涤盖玻片。

吸去多余液体，但保持表面湿润。用移液器将100微升浓度为50毫克/毫升的mPEG-SVA溶于10毫摩尔/升、pH 8.5的HEPES溶液中，滴加至盖玻片表面，在室温下孵育1小时。随后，用10毫摩尔/升、pH 8.5的HEPES溶液冲洗盖玻片。

然后在表面加入 2 µL PLPP 凝胶，再加入 40 µL 乙醇。轻轻倾斜培养皿以混匀溶液。静置 5 分钟，使溶液聚合。

将盖玻片放入35毫米底部带孔的培养皿中。将含有盖玻片的培养皿置于显微镜载物台上。调节焦距至玻璃表面。

加载并锁定预先绘制的图案。以30毫焦耳/平方毫米的紫外剂量开始图案化。完成图案化步骤后，取出图案盖玻片，并用PBS冲洗表面。

将样品与100微升含有25微克/毫升纤连蛋白和25微克/毫升Alexa 488标记纤维蛋白原的PBS溶液混合，在室温下孵育1小时。制备水凝胶基质时，首先将甲基丙烯酸酯化盖玻片放入培养皿中。首先，在15毫升Falcon管中加入9.55毫升双蒸水，新鲜配制氧化HEA溶液。

然后向溶液中加入0.5毫升HEA。再向溶液中加入42毫克偏亚硫酸氢钠。将溶液置于摇床中振荡4小时。

然后，根据表1将丙烯酰胺、双丙烯酰胺和双蒸水混合，配制储存液。储存液可在4摄氏度下保存长达一年。通过将99.3微升储存液与0.5微升1%过硫酸铵和0.2微升TEMED混合，配制下层工作液。

从溶液中取 10 微升，用移液器逐滴加到甲基丙烯酸酯化盖玻片上。小心地将一个 15 毫米圆形盖玻片置于液滴上，静置 45 分钟使其聚合。接着，用手术刀小心剥离顶部的盖玻片。

然后，通过将93.3 µL储备液与1 µL氧化的HEA、5 µL荧光微球、0.5 µL 1%过硫酸铵和0.2 µL TEMED混合，制备上层工作溶液。从中取出5 µL溶液，用移液器逐滴加到底层水凝胶上。小心地将微图案盖玻片放置在液滴上。

等待45分钟使其聚合。用解剖刀轻轻剥离盖玻片，并将盖玻片粘附到定制钻孔的六孔板底部。

向孔中加入 PBS。为观察细胞，吸去六孔板中的 PBS。对于成纤维细胞，加入含 L-谷氨酰胺的高糖 DMEM，并补充 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。

将细胞在37摄氏度和5% CO2条件下孵育过夜。打开显微镜载物台的CO2和加热装置。然后开启显微镜，并将培养板放置在载物台上。

设置照明模式并标记感兴趣的细胞。重新对焦至水凝胶表面。在明场通道中采集细胞的图像。

为了获取变形状态下微珠的图像，切换至 Cy5 通道。然后切换至激光通道，并按照指定模式照射细胞三分钟。这相当于 6,000 毫焦每平方毫米的剂量。

然后，切换通道并获取微珠在未变形状态下的图像。为了计算牵引力，打开已校正侧向漂移的荧光微珠图像。牵引力的完整分析详见附带的脚本。

为了验证细胞对水凝胶表面微图案区域的选择性黏附，使用预先标记的基质蛋白进行荧光显微镜成像，并通过宽场显微镜观察细胞。通过混合不同量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺来调节聚丙烯酰胺水凝胶的机械性能。采用原子力显微镜进行纳米压痕实验，评估水凝胶的刚度。

在对聚丙烯酰胺水凝胶中微米尺度区域施加空间和时间上可控的紫外激光束照射后，进行牵引力测量。通过使用正则化傅里叶变换牵引力显微技术（regularized FTTC）重构牵引力，其中正则化参数由广义交叉验证法确定。我们基于牵引力显微镜结合光诱导微图案细胞释放的模块化模型方法具有多功能性，可进一步与其他显微镜和成像系统联用，以提高其分辨率和灵敏度。