TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题，例如在基因组范围内，不同细胞类型中染色质修饰的调控程度如何。该技术的主要优势在于，我们能够从特定靶细胞中分离染色质，随后进行常规的gypsy下游分析。因此，该方法可为神经元特异性的trimincil、lysinc 4及opisoncilly提供深入见解。

该方法也可应用于其他组蛋白修饰、其他细胞类型以及其他模式生物。演示该实验步骤的是我实验室的技术员 Mari Mito。首先，使用精细的弹簧剪将目标组织剪切成小块。

将组织碎片加入装有液氮的洁净容器中。然后，将组织碎片转移至装有液氮的2毫升离心管中。打开管盖，在-80°C条件下保存5分钟，以使液氮挥发。

将含有组织样本的离心管置于预冷的金属冰架上。然后，将一个金属弹丸放入1.5毫升离心管中，并用液氮预冷。将预冷的金属弹丸放入其中一个样本管中。

盖上管盖，将试管放入冷冻研磨机的试管架中。立即把组装好的试管架浸入液氮中一分钟。将冷冻的试管架插入冷冻研磨机的外盒中。

然后用力振荡30秒，共60次。之后，拆开冷冻研磨仪，取出金属研磨珠，并将离心管放入预冷的样品冷却器中。

将冷却器在负20摄氏度下保存15分钟。然后，向管中加入900 µL的1%甲醛，并用移液器混匀。将悬浮液转移至含有900 µL 1%甲醛的新2 mL管中。

接下来，在23摄氏度下轻轻旋转孵育10分钟以固定悬液。为终止固定反应，向管中加入100微升2.5摩尔的甘氨酸。然后在4摄氏度下以3,000 × g离心5分钟。

此后，弃去上清液。向离心管中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋混匀。在4°C条件下，以3,000 × g离心5分钟。

重复此洗涤步骤，再进行两次。接着，向沉淀中加入500 µL裂解缓冲液一，并用移液器吹打混匀。将离心管在4 °C、3,000 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液。

向沉淀中加入1毫升裂解缓冲液二，涡旋混匀。然后，在4°C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。随后，向沉淀中加入800微升含有蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析缓冲液，用移液器吹打混匀。

将悬液在4°C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。接着，向沉淀中加入500 µL含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液。然后，将悬液在4°C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。

加入1 mL含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液。加入含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液后，立即将裂解液转移至超声破碎管中，并将管子置于超声破碎仪上。

根据文本方案中所述的设置，对染色质进行超声剪切。然后将样品转移至一个1.5毫升的低吸附蛋白管中，并在4°C条件下以20,000 × g离心5分钟。

收集样品的上清液，并转移至新的低吸附蛋白管中。本方案中介绍并演示了串联染色质免疫沉淀测序技术。在实验过程中，于多个步骤对DNA的质量进行了检测。

超声处理后立即分离剪切的DNA，并使用微流控电泳仪进行检测。使用抗FLAG抗体和抗H3K3me3抗体进行亲和纯化后，再次检测DNA质量。通过阴性对照样本验证了H2B-FLAG上DNA免疫纯化的特异性。

当检测到的DNA量可忽略不计时。在后续实验步骤中，对测序文库的质量进行了验证。通过使用靶向GAPDH基因启动子区域的引物进行富集分析，证实了ChIP和T-ChIP实验的成功。

获得了沿三个神经元基因的代表性重分布结果。观察到神经元T-ChIP-seq相对于全脑T-ChIP-seq在基因5'端出现读段富集。该技术稳定后，将为表观遗传学领域的研究人员广泛探索小鼠神经元中细胞类型特异性的组蛋白修饰铺平道路。

请注意，接触甲醛可能具有极高危险性，进行此操作时务必采取预防措施，例如穿戴橡胶防护服和护目镜。