自动化 ChIP-seq 实验以在 10,000 个 HeLa 细胞中生成表观遗传谱型

本实验的总体目标是为研究人员提供一个自动化平台，能够在仅 10,000 个细胞上完成染色质免疫沉淀实验。该目标首先通过制备高质量的剪切染色质以用于染色质免疫沉淀来实现。在第二步中，建立自动化的染色质免疫沉淀实验，并对免疫沉淀获得的 DNA 进行自动化文库构建与测序。

通过定量PCR和高通量测序分析免疫沉淀的DNA。最终，可通过将自动化技术在原始10,000个细胞样本上生成的染色质免疫沉淀测序谱，与在100,000个细胞上进行的实验以及现有参考数据集进行比较，来验证该技术的成功性。该方法有助于回答表观遗传学领域的关键问题，从而加深我们对特定生物标志物在不同组织中功能的理解。

发育阶段与疾病状态。该技术对多种疾病的诊断具有重要意义，将有助于识别健康与疾病状态下的表观遗传生物标志物，准确且可靠。自动化技术是研究人员进行特定细胞类型、亚群及活检组织表观遗传分析的重要工具。

进行标准的自动化染色质免疫沉淀实验时，首先向来自一百万至两百万个细胞的100微升剪切染色质中加入120微升染色质免疫沉淀缓冲液H，并保留2至20微升染色质作为输入样本。然后在IP star compact仪器上设置自动化实验，选择相应程序并点击染色质免疫沉淀图标。选择染色质免疫沉淀直接法，接着在下一个界面中选择200微升染色质免疫沉淀程序，并指定样本数量。

将染色质免疫沉淀实验参数设置为：抗体包被时间为4小时，免疫沉淀步骤为15小时，每次洗涤步骤为5分钟。然后根据布局信息屏幕上的说明准备试剂，并加入相应的试剂以及经过高度验证的ChIP-seq级抗体。

然后向每个反应中加入20 µL蛋白A包被的磁珠，以及染色质免疫沉淀（ChIP）过夜反应完成并解除交联后的染色质样品。使用基于磁珠的DNA纯化试剂盒纯化DNA。采用高灵敏度的商用荧光定量检测法对免疫沉淀得到的DNA进行定量。

接下来，使用至少一个阳性对照和一个阴性对照基因组区域的引物，根据分析所用材料的适当参数，通过定量 PCR 分析免疫沉淀 DNA 的质量。结果以相对于输入 DNA 的回收率百分比表示，用于下一代测序的实验方案。

现在点击文库制备图标，然后选择偏好的文库制备技术，并根据布局信息屏幕上的说明设置试剂。例如，在本实验中，生成了与基因表达相关的六种不同组蛋白修饰的测序谱。这些组蛋白标记物之间观察到的高度峰相关性表明，该自动化系统能够生成准确且可靠的数据。

此外，这些图表展示了不同组蛋白修饰在特定基因组区域的峰分布情况。最后，对于细胞数量较少的样本，进行自动化染色质免疫沉淀实验时，如前所述，在自动化系统上设置200微升的自动化染色质免疫沉淀方案。接下来，将ChIP-seq级别的抗体和试剂加载到系统中，这些试剂已优化用于处理10,000至100,000个细胞的染色质样本，每个反应仅需10微升蛋白A包被的磁珠。

芯片运行后，进行文库制备，选择微量文库制备方案，并根据布局信息屏幕上的说明准备试剂。在此代表性定量 PCR 实验中，起始样本为 10,000 个细胞的染色质免疫沉淀结果显示，在阳性对照区域使用抗组蛋白抗体观察到显著富集，而在阴性对照区域信号可忽略不计。此处展示了一系列 10 次免疫沉淀反应，其结果具有可重复性，并且与手动染色质免疫沉淀实验高度一致，证明了该自动化系统在低细胞数量条件下工作的能力，且与手动免疫沉淀相比，实验间变异性无明显增加。

这些数据展示了对 10,000 和 100,000 个起始细胞数量的染色质免疫沉淀样品所获得的序列文库进行的生物信息学分析，结果表明即使在细胞数量较少的情况下，仍可获得优异的实验结果。该数据集对应于起始材料为 10,000 个细胞的实验，其背景噪声较低，并呈现出高度可靠的富集峰，这些富集峰结果已通过 100,000 个细胞的数据集以及 Broad Institute 参考数据集共同验证。

对于ENCODE项目而言，值得注意的是，10,000个细胞的数据与布罗德研究所的数据展现出几乎相同的峰图模式，依据ENCODE项目中所使用的显著性评分对前40%最显著的峰进行比较，其重叠比例高达98%。IP-Star自动化系统仅需极少的人工干预，可将染色质免疫沉淀实验的操作时间缩短至仅一到两小时。此外，该自动化流程取代了传统手工染色质免疫沉淀中多个易出错的步骤，能够提供高度一致的实验结果。

在进行该实验操作时，必须牢记：良好的染色质免疫沉淀以及选择高特异性和高灵敏度的抗体是实验成功的关键。该技术为各个生物学领域的研究人员提供了新途径，有助于提高治疗方案的准确性、可重复性和一致性。表观遗传学研究。