研究切叶蚁对病原体攻击行为防御的可视化指南

可视化实验方案为研究切叶蚁防御行为提供了参考框架。该方法的主要优势在于，有助于研究人员识别关键的防御行为，从而为后续研究建立统一的认知基础。对于不熟悉此类行为的年轻研究人员而言，切叶蚁研究的参考标准可能尤为有用。

其中许多行为较为罕见，因此经验丰富的研究人员可能从未观察到过。本指南通过图示关键的防御行为并提供一致的定义，将有助于不同研究及蚂蚁物种之间的比较。此外，在可控条件下理解这些行为，将有助于在自然栖息地开展的研究，因为在自然环境中条件难以控制。

首先，通过将去除蚂蚁的刺叶蚁（Acromyrmex echinatior）实验室菌群中的菌圃碎片放置于含有湿润棉絮的培养皿中数天，以分离 Escovopsis 菌株，直至 Escovopsis 发芽并产生孢子。将孢子转移至马铃薯葡萄糖琼脂平板，于约 23°C 下培养两周。使用无菌针头从平板上刮取成熟孢子。

然后，在无菌条件下将孢子接种到新的培养皿上，并在约23摄氏度下培养两周。当菌丝生长至覆盖整个培养皿并形成成熟的褐色孢子后，再次在无菌条件下将孢子接种到新的培养皿上。利用三个原始的A. Echinatior菌落，从每个母菌落获得12个子代菌落，共获得36个子代菌落。

在引入蚂蚁前4小时，向盒子中加入一茶匙大小的原始菌落真菌园、一些悬钩子叶片以及一块浸过水的棉球。对于需要感染的子菌落，用接种环取满Escovopsis孢子，然后轻轻敲击真菌园的一小部分10至20次，以完成孢子接种。

对于对照亚群落，用无菌接种环轻敲真菌园圃10至20次，以模拟埃斯科孢子（Escovopsis spores）的施加过程。对于感染后72小时的观察，自引入埃斯科孢子后，将一半的亚群落保持静置72小时不予干扰。对于感染后零小时的观察，在开始记录前30分钟，立即从母群落中向每个盒子添加两个卵、四只小型工蚁和四只大型工蚁。

然后，在开始记录前30分钟，将相同的工蚁混合物添加到感染后72小时的观察组中。对每个亚群体进行连续四小时的视频录制。在完成全部36个亚群体的录制后，回看录像资料，并对每个亚群体中每个个体的目标行为进行评分。

以下片段描述了观察过程中需注意的关键特异性行为。观看视频时，请注意蚂蚁是否停止腿部运动以开始自我梳理行为。检查触角是否通过前足上的触角清洁器。

然后，蚂蚁应使用口器清洁其足部和触角清洁器。同时，注意观察蚂蚁是否在菌圃的某一固定位置停止了足部的任何运动。观察其触角是否静止不动且相互平行，指向菌丝体，并在接近上颚末端处几乎相互接触。

然后，蚂蚁的口器会伸出来舔舐真菌。一只或多只蚂蚁还可能相互理毛。在此行为期间，蚂蚁会停止所有活动，紧密地靠在一起，保持身体接触。

然后，进行梳理的蚂蚁应将触角指向接受梳理的蚂蚁，并轻轻触碰接受者。注意观察梳理个体的上、下口器张开，舌状结构伸出以舔舐接受梳理的蚂蚁。观察蚂蚁何时停止活动，以开始对后胸腺进行梳理。

蚂蚁应向一侧倾斜，用一条前腿向后伸展以摩擦腺体开口，同时用舌器舔舐另一条前腿。随后，蚂蚁会用相反的一对腿重复该行为。当蚂蚁在菌圃的某一固定位置停止腿部运动时，应注意其触角静止不动且相互平行，指向菌圃的某一固定位置。

然后，蚂蚁会抓住可见的埃斯科维普西斯（Escovopsis）孢子，并将其运出巢穴。蚂蚁还可能在真菌的某个固定位置停止腿部运动，将触角松散地指向一块真菌，并用触角轻触该真菌块。此后，蚂蚁会将这块真菌从其余的真菌培养物中分离下来。

当一只蚂蚁在菌圃的固定位置停止腿部运动时，可能观察到另一种潜在行为。该蚂蚁会将腹部和头部相互弯曲，以便将一滴粪液涂抹到口器上。随后，蚂蚁会依次将前足通过上颚清理，并将触角通过触角清洁器进行清洁。

本研究的主要目标是建立一个短片段目录，展示切叶蚁在防御疾病时的行为。本实验方案中描述的行为是在实验性感染情境下进行评分的。在对照组蚁群中，小型工蚁对菌园作物的梳理行为多于大型工蚁。

在受感染的菌落中，与对照菌落相比，真菌梳理行为有增加的趋势，但差异无统计学意义。感染与粪便梳理行为的轻微增加相关，但未检测到小型工蚁与大型工蚁之间的差异。孢子清除和真菌清除行为的发生频率均较低，且在受感染菌落与对照菌落之间未观察到显著差异。

观察到真菌清除行为随感染时间延长而增加的趋势。在感染初期的少数菌群中，经过四小时的观察期后，几乎没有可见的孢子残留。有趣的是，在感染后期条件下，蚂蚁无法完全清除任何菌群中的孢子。

因此，本实验的结果形象地展示了如何通过剪辑片段的汇编来开展行为学研究，以计算小型和大型工蚁行为的平均频率。我们记录了有助于真菌种植蚂蚁防御行为的相关活动，并已系统性地识别、描述并以影像方式捕捉了这些行为。我们的研究结果进一步支持了该领域的研究结论，即当病原体面对一系列复杂的行为以及相关的抗菌化合物时，很难成功感染蚁群。

我们为该领域的未来研究提供了一种新工具，并希望该行为目录将有助于在行为的定义、观察和解释方面达成共识并实现标准化。