切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

我们研究生活在切叶蚁真菌园中的微生物群落。我们希望了解这些微生物的种类以及它们如何构建这一微生物生态系统。特别是，我们希望了解这些微生物群落与蚂蚁所培育的真菌之间在物理层面如何相互作用。

而这些相互作用主要由生物膜介导。蚂蚁培育的微生物园是一种复杂且异质的样本，由培育的真菌、用于培养的基质以及微生物群组成。除了非常脆弱之外，要找到能够保存花园所有组分以用于成像的方法也极具挑战性。

我们的研究结果表明，微生物群落整合了真菌园的结构，同时也支持了它们可能参与该环境生理反应的观点。我们还提供了证据，证明生物膜在这些相互作用中具有重要作用。我们的实验方案在保留生物膜中真菌结构的同时，简化了其他操作步骤。

然而，该方法能够保持花园结构的精细性，进一步揭示微生物群与基质的物理相互作用，并展现生物膜的空间结构。生物膜是一种细胞系统，其中微生物嵌入胞外多糖（EPS）基质中，形成社会性网络。扫描电子显微镜使我们能够以前所未有的细节观察微生物群在真菌园中的空间组织方式，包括菌丝周围及整个基质表面的分布情况。

我们认为，此处建议的制备步骤将被广泛应用于其他微生物生态系统研究的优化。首先，定位并标记切叶蚁物种的蚁群。在蚁巢周围挖掘一条沟槽，直至暴露菌圃室。

横向打开花园培养室，以防止土壤在花园表面坍塌。使用昆虫学镊子小心采集花园样本。将花园样本转移至一个干净的塑料容器中，容器内含有一层石膏以平衡湿度。

转移花园和蚂蚁工蚁后，将容器密封以防止样品干燥。使用先前移除的土壤填埋沟槽。将花园样品置于23至25摄氏度下保存，直至进一步处理。

进行样品固定时，使用昆虫学镊子从园地样品中取出工蚁、卵、蛹和幼虫。将不超过五立方毫米的园地碎片留出，并加入至2毫升离心管中。然后用巴斯德玻璃移液管向管中加入约1毫升卡诺夫斯基固定液，以完全浸没样品。

轻轻振荡试管，使样品充分浸透，并在4°C下孵育样品至少24小时。首先，获取含有瘤胃蚁属（attine ant）物种菌落片段的卡诺夫斯基固定液（Karnofsky fixative）样本。固定后，使用玻璃移液管将卡诺夫斯基固定液完全移除，注意不要破坏样本。

依次用一毫升浓度递增的乙醇孵育样品，确保样品保持静止。完全去除乙醇后，使用镊子和刮刀小心地将样品转移至临界点干燥仪的样品容器中。盖上容器盖子，并将其浸入盛有足量100%乙醇的刻度玻璃烧杯中，使容器完全浸没。

然后将样本容器转移至另一个含有足量100%乙醇的刻度玻璃烧杯中，在室温下孵育10分钟。随后将容器转移至临界点干燥仪中。

首先，获取经过临界点干燥处理的切叶蚁物种菌落片段。准备样品台时，用一片铝箔包裹样品台，仅覆盖其顶部。在用双面导电碳胶带覆盖样品台的上部之前，先在每个样品台的底部标记样品编号或代码以进行识别。

然后打开样品容器的盖子，使用镊子和刮刀小心地将干燥的样品转移至玻璃培养皿中。将花园样品的碎片小心地放置在覆有胶带的载片黏性表面上。经喷金镀膜后，将载片放入样品台，用于扫描电子显微镜观察。

使用屏幕上的选项或手动控制来调整放大倍数和图像位置。移动载物台以全面观察样本。使用RDC功能对特定区域进行聚焦。

观察到有趣结构时，应相应调整放大倍数、焦距、亮度、对比度和消像散。为正确进行消像散，使用手动用户界面，在 X 和 Y 方向上移动载物台。调节扫描速率以检查图像分辨率。

根据成像部位调整放大倍数。保存图像时，使用冻结功能并点击照片图标。设置图像保存的文件路径。

最后，分析至少三个菌圃片段，拍摄所有提及放大倍数范围下的图像。在切叶蚁菌圃中观察到的真菌菌丝呈现为覆盖基质表面的完整管状结构，表明样品制备效果良好。扩散的生物膜则由微生物细胞构成，形成覆盖基质表面的单层至三层细胞的薄层结构。