一个 体外 平行板灌注系统模型用于研究细菌对移植物组织的黏附

该方法有助于解答感染性心内膜炎发病机制中的关键问题，并通过研究细菌、血细胞与心肌组织内皮细胞之间相互作用等领域的路径生物学图谱。该技术的主要优势在于，组织移植物可在标准化的流动条件下直接暴露于细菌、血小板和蛋白质等多种靶标之间的相互作用中。该技术的应用意义延伸至感染性心内膜炎的治疗领域，因为它能够揭示驱动某些组织高感染性的关键分子相互作用及相关因素。

该方法有助于深入了解赘生物形成的发病机制，也可应用于血管通透性、细胞迁移以及基因细胞表达的相关研究。开始实验前，将一枚预先制备好的组织活检样本（直径10毫米，厚度相同）置于载玻片与一个内径8毫米的圆形穿孔之间，并将带有内表面朝上的橡胶垫圈放置其上，以接触细菌悬液。

将组织移植物放入支架时，需注意其方向。确保组织内表面（即已暴露于血液的一面）朝上，以接触实验培养基。接着，将带有组织的支架插入腔室底部金属框架中嵌入的垫圈片内。

将上部金属框架连同相应的垫片一起安装到已插入组织固定器的腔室底部。然后使用八个螺钉和螺母将整个腔室固定。通过使用卡尺或直尺，确保各移植物之间的腔室高度始终保持一致。

接下来，将流室与蠕动泵连接。然后，将400毫升的液体储液器通过管路连接。使用蠕动泵和细菌储液器，以每平方厘米3达因的剪切应力及相应的4毫升/分钟流速，用100毫升含10⁷个荧光标记菌落形成单位的磷酸盐缓冲液悬浮液对组织灌注1小时。

使用相同的收集储液器连续循环100毫升细菌悬液。灌注结束后，拆卸腔室以取出移植物。在12孔板中，用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）在轨道摇床上清洗组织块两次，每次三分钟。

然后使用直径较小的皮肤活检打孔器切割移植物的内部组织。将每份组织活检样本分别放入含有1毫升无菌0.9%氯化钠溶液的14毫升离心管中。使用超声波清洗仪超声处理10分钟，使细菌从组织上脱离。

准备一个14毫升离心管，加入10毫升无菌0.9%氯化钠溶液，用于对超声处理后获得的细菌悬液进行系列稀释。将该管标记为2号。另准备三个14毫升离心管，每管加入10毫升无菌0.9%氯化钠溶液，用于对取自增殖实验的初始细菌悬液进行系列稀释。

将3号、4号和5号试管做好标记。接着，准备三个琼脂平板，分别用于细菌灌注、PBS对照灌注，以及灌注所用的初始细菌悬液。每个平板分为三个区域，按以下方式标记组织实验：10-1、10-3和10-4。

为了计算灌注细菌中的菌落形成单位数量，将平板标记如下：10-1、10-3、10-5 和 10-7。对含有组织活检样本的试管依次涡旋振荡 15 秒，以进行系列稀释。制备系列稀释液时，将 1 号试管中的 100 微升（µL）转移至 2 号试管中，并涡旋振荡试管以充分混匀溶液。

取100微升第一管和第二管中的内容物，分别涂布于琼脂平板上对应的10-1和10-3区域。然后取10微升第二管中的内容物涂布于10⁴区域。重复此步骤四次，以从每份10微升样品中获得四个独立的菌落生长区域。

为制备初始培养物的系列稀释液，首先将稀释液涡旋振荡15秒，然后取100 µL细菌悬液转移至3号管中，并通过涡旋振荡充分混匀。再从3号管中取100 µL加入4号管中，再次混匀。接着从4号管中重复该操作至5号管。

分别取第3、第4、第5号试管以及标记为初始培养物的试管中的内容物各100微升，均匀涂布于血琼脂平板的10-3、10-5、10-7和10-1区域。将血琼脂平板置于超净工作台中晾干细菌涂布液，通常需要10分钟。随后，将平板置于37°C条件下过夜培养。

经过过夜培养后，计数细菌菌落以获得CFU数量。在剪切应力条件下，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在各种移植物组织上的细菌黏附情况相似。按照操作步骤，与牛心包补片相比，缓症链球菌在牛颈静脉壁上的黏附显著减少。

在比较三种细菌时，与金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌相比，血链球菌对牛颈静脉壁的黏附性显著较低。在进行该实验操作时，重要的是要确保已准备好相同来源的正确组织，这将保证所有实验样本之间条件的一致性，并最大限度地减少不同实验批次间的数据变异性。

该技术开发后，研究人员可通过向体外模型中逐步添加不同组分，以逐级探究复杂疾病体系，从而构建出接近临床状态的完整复杂性模型。