在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的募集

该方法有助于解答炎症与免疫学领域中的关键问题。例如，白细胞黏附和跨内皮迁移的分子机制是什么。该技术的主要优势在于，能够无限次地区分单核细胞的跨内皮迁移与对内皮单层细胞的牢固黏附。

尽管该方法可提供有关单核细胞在流动条件下募集的信息，但也可适用于造血系统中的其他细胞，如T细胞、B细胞或其亚群的衍生物。洗涤后，用30微升37摄氏度、添加1微摩尔CMFDA的M199培养基在37摄氏度和5%二氧化碳条件下对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）标记10分钟。孵育结束后，用150微升完全M199培养基洗涤细胞，并在150微升新鲜完全M199培养基中继续培养30分钟。

然后将上清液替换为150微升含有适当实验添加剂的完全M199培养基，并将载玻片培养室放回培养箱中继续孵育6小时。对于人PAN单核细胞的分离，取新鲜采集的血液样本，按1:1比例用添加1毫摩尔EDTA的PBS稀释，小心地将20毫升血液溶液叠加于20毫升密度梯度分离介质上，通过离心进行密度梯度分离。收集中间的外周血单个核细胞-血小板层至一个新的50毫升离心管中，管内预先加入40毫升含1毫摩尔EDTA的PBS，并用额外的PBS-EDTA补至终体积50毫升。计数后，按照试剂盒生产商的说明，使用PAN单核细胞分离试剂盒分离单核细胞。

用添加了0.5%牛血清白蛋白（BSA）的M199培养基洗涤细胞三次，以去除EDTA的任何残留。单核细胞分离的质量对于确保可靠的跨膜迁移和黏附结果至关重要。因此，严格遵循制造商提供的分离方案非常重要。

将沉淀重悬于新鲜M199培养基中，调整浓度至每毫升含6×10⁶个单核细胞，并添加0.5% BSA。根据趋化实验所需，将细胞分装至各微量离心管中，每管200 µL。随后将细胞于37°C孵育20分钟，再注入流式腔室。为准备流体系统进行分析，首先将一个雄性鲁尔接头插入一段长8 cm、直径3 mm的硅胶管一端，另一端连接至管内鲁尔注射装置。

然后将鲁尔接头连接到一段长40 cm、厚3 mm的硅胶管的一端。接着，将20 ml注射器连接到一段长1 m、厚3 mm的硅胶管的一端，并在另一端插入一个雄性鲁尔接头。然后将两个雄性鲁尔接头插入一个雌性鲁尔锁紧耦合器中，并将硅胶管的游离端放入含有37°C M199培养基的储液器中，该培养基添加有0.5% BSA。

回抽活塞，使管路充满流动缓冲液，并将注射器固定在注射泵上。然后将泵设置为抽取模式，并设定流速。连接载玻片腔室时，将硅胶管夹紧在雌性鲁尔锁接头耦合器周围，并断开耦合器上的两个雄性鲁尔接头，以便将其连接到载玻片的储液池上。

气泡不仅会干扰成像质量，还会对细胞产生毛细管剪切应力，导致细胞死亡。为避免气泡产生，在将鲁尔接头插入储液池前，需确认管路已正确夹紧。随后打开夹子，检查连接处无泄漏，再将载玻片置于显微镜下。

为在流动条件下成像单核细胞的募集过程，将5微升荧光标记的抗CD16抗体和适量的核染料加入每份分装的单核细胞中，室温孵育10分钟，随后短暂离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于250微升流动缓冲液中，并启动注射泵。取30微升单核细胞悬液加入载玻片的一个腔室中，在共聚焦显微镜下选择40倍物镜开始观察。

启动适当的荧光激光器，并使用含有标记单核细胞的腔室设定共聚焦显微镜的采集参数。接下来，在半厘米半径范围内选择三个视野进行多点共聚焦成像，设置Z轴堆栈范围为10至12微米，时间推移采集间隔为每分钟一次。成像3分钟后，通过串联鲁尔注射口注入200微升单核细胞，开始成像细胞相互作用过程。至少30分钟后，停止成像和流动，夹闭管路以便将其从载玻片上断开。

为了确定细胞穿过经刺激的 HUVEC 的迁移率，打开 ImageJ 软件，计数每个视野中黏附的单核细胞总数，以确定每平方毫米的细胞数量。然后计数位于内皮细胞下方基底层平面上的已迁移单核细胞数量，这些细胞可通过其细胞核周围存在黑色空晕区来识别。一种简便的方法是通过观察 HUVEC 在炎症应激条件下是否发生伸长，来评估其激活状态。

延时共聚焦成像可实现对位于顶端层面单核细胞的可视化观察，从而评估其表型。发生跨内皮迁移的迁移细胞会移向细胞间连接处，随后从顶端层面消失，并在基底层面重新出现。随时间变化对单核细胞募集进行定量分析证实，单核细胞黏附之后即发生跨内皮迁移。

当内皮细胞仅受到TNF alpha刺激时，CD16阳性单核细胞的跨内皮迁移率较低；但当内皮细胞同时受到TNF alpha和血管内皮生长因子（VEGFA）刺激时，迁移率增加。与CD14阳性单核细胞相比，HUVEC在受到TNF alpha以及TNF alpha联合VEGFA刺激后，对CD14阴性T细胞、B细胞和NK细胞的黏附能力增强。此外，HUVEC的刺激仅诱导单核细胞群体发生跨内皮迁移，而在TNF alpha或TNF alpha联合VEGFA的刺激条件下，T细胞、B细胞和NK细胞均不发生跨内皮迁移。

为了进行最佳的单核细胞趋化实验，重要的是您需要提前规划实验，并在同一天完成操作。在分离细胞时，请确保显微镜处于37摄氏度，以避免实验过程中将细胞转移至不同温度环境。为了深入掌握该操作流程，还可开展其他方法，如HUVEC细胞因子和趋化因子表达谱分析以及趋化迁移研究，以进一步探究维持特定单核细胞群体跨内皮迁移和黏附的分子机制。