慢性炎症状态下单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的定量分析

本实验的总体目标是定量评估来自人类临床样本的单核细胞穿越内皮细胞迁移及形成泡沫细胞的能力。该方法可用于回答心血管领域中的关键问题，例如评估有急性冠状动脉疾病风险个体的细胞致动脉粥样硬化潜能。该技术的主要优势在于，既可使用新鲜全血，也可利用储存的患者队列样本进行检测。

此外，泡沫细胞的形成可以通过显微镜和流式细胞术进行定量。首先，从新鲜的胶原蛋白悬浮液制备聚合的胶原凝胶。向一个5毫升的聚苯乙烯管中，依次加入氢氧化钠、10倍浓度的M199培养基、乙酸，最后加入纤维状胶原蛋白。

用移液器充分混匀。随后，将50微升分装至无菌平底96孔细胞培养板的内侧孔中。在板的外周孔中加入200微升1倍浓度的杜氏磷酸盐缓冲液，以防止干燥。

在37摄氏度孵育两小时后，胶原蛋白将发生聚合。随后，每孔加入150微升一倍浓度的补充M199培养基覆盖凝胶，并继续孵育至使用前，通常为五天后。为扩增保存的人脐静脉内皮细胞，用1毫升纤连蛋白溶液处理一个25平方厘米的培养瓶，室温孵育10分钟。

同时，将储存的细胞在水浴中解冻，以M20重悬细胞。细胞解冻后，吸除培养皿中残留的纤连蛋白溶液，并接种细胞。随后，每两到三天更换一次培养基，培养至细胞融合。

培养至第5天时，HUVECs应达到汇合状态。通过吸除培养瓶中的上清液来分离细胞，然后使用2至3毫升的1×PBS洗去含血清的培养基。随后，加入5毫升稀释的胰蛋白酶，在室温下短暂孵育，并轻轻摇动细胞，直至细胞脱落。

然后，用5毫升M20快速收集细胞，将悬液转移至10毫升离心管中并离心收集细胞。接着，将细胞重悬于M20中，浓度为每毫升200,000个细胞。随后，吸除预先制备的胶原板中的M199培养基，并向每孔凝胶中加入100微升HUVECs。

继续培养三天。在培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的第8天，在加入单核细胞之前激活单层细胞。吸除上层培养基后，向每个孔中加入100 µL人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）溶液。

然后，将培养板在37摄氏度下孵育4小时。孵育结束后，移除培养基，并用100微升M199培养基洗涤凝胶两次。接着，在100微升M20培养基中加入50,000个 freshly isolated monocytes 或纯化的单核细胞亚群，加入至HUVEC单层细胞中。

加入单核细胞后，将培养板孵育1小时，以允许细胞进行正向转迁移。1小时后，收集洗液中的未转迁移细胞。首先，使用每孔100微升的EGTA溶液进行两次洗涤并合并洗液。

然后，在 4 摄氏度条件下，以 300 ×g 离心 5 分钟，沉淀合并的洗涤液。弃去上清液，将细胞重悬于 30 µL PBS 中，并对细胞进行计数，以确定前向迁移细胞的百分比。接着，用 M199 洗涤培养板孔一次，每孔加入 100 µL 新鲜 M20 培养基，将培养板继续孵育 2 天。

两天后，重复使用 EGTA 洗涤液收集非迁移细胞的操作步骤，以收集反向迁移的细胞，并继续进行细胞的表型分析。为了通过流式细胞术对凝胶结合细胞进行表型表征，加入 100 µL 37°C 的胶原酶 D，37°C 下孵育 20 分钟以消化细胞。孵育结束后，使用 200 µL 移液枪头研磨凝胶，并继续孵育 20 分钟，以彻底消化凝胶。

完全消化后，将消化后的重复凝胶样品通过35微米尼龙滤网过滤，并收集到预冷的FACS管中。随后，用冷的FACS洗涤液将滤过的细胞洗涤一次。离心细胞，并将其重悬于100微升冷洗涤液中。

然后，根据文中的实验方案进行FACS染色和分析。若需通过显微镜分析细胞，首先按照文中的实验方案对细胞进行染色。为分离染色后的细胞，使用21号针头沿孔壁划圈，针头斜面朝外。

接下来，准备用于固定凝胶的载玻片。在一条双面胶带上打两个小孔，然后将胶带固定在载玻片上，并移除保护层。接着，向胶带上的每个孔中加入一滴水。

然后，使用镊子将两块凝胶轻轻转移至两个孔上，并覆盖胶带。最后，小心地将盖玻片贴附到胶带上，进行细胞的观察。跨膜迁移结束后，按照前述方法对未迁移的细胞进行计数。

共回收了 15,000 个未发生前向迁移的细胞，前向迁移率确定为 95%。经过 48 小时的进一步培养后，回收了 36,000 个反向迁移的细胞，相当于 12.6% 的反向迁移率。用油红 O 染色凝胶后，可见由白色箭头指示的泡沫细胞和由黑色箭头指示的巨噬细胞。这些单核细胞在迁移过程中经氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）处理，该物质在传统的泡沫细胞诱导模型中用于诱导泡沫细胞的形成。

来自12名供体的细胞计数数据汇总证实，单核细胞与氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）共孵育时，比与天然型低密度脂蛋白（native LDL）或单独M199培养基孵育时诱导形成更多的泡沫细胞。对跨内皮迁移的细胞也进行了流式细胞术分析。在排除死细胞、双联体以及CD45阴性的HUVECs后，选取主要的迁移细胞群体，并将目标受体的平均荧光强度与荧光减一（fluorescence minus one）或同型对照数据进行比较。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该检测方法对人源临床样本中的单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成进行定量分析。请务必注意，处理人源临床样本可能具有极高的危险性，必须始终采用规范的实验室操作技术。