使用蚂蚁Vollenhovia emeryi进行近交系杂交的诱导与评估

该方法有助于解答膜翅目昆虫分子生物学和遗传学领域的关键问题，例如性别决定系统。该技术的主要优势在于，我们能够轻松地在伏蚁属（Vollenhovia Emery）蚂蚁中诱导产生近交系，这对于遗传图谱构建和分子状态研究至关重要。因此，该研究可为特定蚂蚁的性别决定系统提供深入见解，并且也可应用于其他蚂蚁及其他膜翅目物种（如黄蜂）的研究。

开始实验方案时，于初夏采集 V.Emeryi 蚂蚁群落。使用吸虫器将采集到的枝条上的蚂蚁标本转移至带有玻璃盖的人工石膏巢穴中。将蚁群饲养在人工巢穴内，温度维持在 25 摄氏度，光照周期为 16 小时光照与 8 小时黑暗交替。

使用洗瓶每隔一天在同一时间提供自来水，以保持石膏湿润。接下来，每隔一天向蚁群中添加约100微克用铝箔包裹的干燥蟋蟀粉以及含有红糖水的吸头，使用20微升吸头，直至新的繁殖型蚂蚁出现。重要的是要从野外采集小规模蚁群，并提供充足的食物，以获得新的蚁后和雄蚁。

首先，将蚁群置于温度控制在 4°C 的环境中静置 15 分钟，以阻止个体活动。在体视显微镜下使用镊子去除 30 只工蚁的中足，以便将 F 零代个体与后续近交杂交产生的工蚁区分开来。然后将蚂蚁转移至新的较小的石膏巢穴中进行近交杂交。

接下来，将三到四只幼虫或蛹放入含有工蚁的石膏巢穴中。将一只长翅雌蚁和一只雄蚁转移到预先准备好的石膏巢穴中进行近交杂交。在此步骤中，重要的是保持实验杂交群体的状态与正常群体状态一致。

仅通过将雄性和雌性放在一起难以诱导近亲繁殖。将种群维持在25摄氏度下，采用16小时光照、8小时黑暗的光周期，并提供食物和水，直至蚁后失去翅膀并产卵。每天在体视显微镜下检查实验种群。

在建立F一代后代之间的近交杂交后，可在体视显微镜下观察卵。当F一代蜂王开始产卵后，将F一代雄蜂及幼虫或蛹从巢中移除，以防止F一代与F二代混合。保持各蜂群在相同条件下饲养，直至F二代后代羽化出现。

使用镊子取下一只F型零级蜂王的一条腿，将该腿转移至含有100 µL冷冻剂的1.5 mL微量离心管中。在体视显微镜下，用镊子于盛有300 µL超纯水的玻璃培养皿中解剖雌性蜂体腹部。

解离含有精子的精囊，这些精囊来自已交配的雄性个体。用昆虫针剥离精囊组织，并从雌性组织中分离出精子。使用微型移液垫，将精子转移至含有100 µL冷冻剂的1.5 mL微量离心管中。

将F零代蜂王和精子的样品在95摄氏度下孵育20分钟。迅速将微量离心管封闭，并将样品储存在4摄氏度下。在确认经siv交配的F一代蜂王产卵后，利用其脱落的翅膀或一条中足提取蜂王的DNA，并进行基因分型。

接下来，通过采集F一代雄蚁的一条腿进行基因分型，以提取其DNA。为了评估近交杂交所得雄蚁的生育能力，使用镊子在盛有400 µL PBS溶液的玻璃培养皿中解剖其内部生殖器官。然后吸除PBS溶液，并用移液器加入4%多聚甲醛溶液。

将样品在室温下用PFA孵育40分钟以固定组织。固定后，使用微量移液垫用400 µL PBS洗涤组织5次。用PBS将DAPI溶液稀释至1 mg/mL。

吸除 PBS，向组织中加入约 300 微升稀释后的 DAPI 染色液。在室温避光条件下孵育 15 分钟。孵育结束后，用 400 微升 PBS 洗涤组织 5 次，并用镊子将组织转移至玻片中央。

然后将组织切片置于含有TRITC四甲基罗丹明的封片剂中。最后使用共聚焦激光扫描显微镜，配合20或60倍物镜观察样本。单倍体雄性v Emeryi的睾丸显微图像显示存在健康的纤维组织或精子，而在二倍体雄性v Emeryi中则未观察到健康的纤维组织，也无精子存在。

二倍体雄性 Emeryi 的雄性生殖器官不产生精子，其睾丸也不发育，这表明近交杂交产生的雄性是不育的。该技术建立后，为我们探索伏蚁属 Emeryi 这一快速繁殖蚁类中的性别决定机制铺平了道路。