建立和分析肿瘤组织切片外植体作为诊断检测的先决条件

该方法有助于回答临床前研究中的关键问题，其中肿瘤组织切片的药物反应研究可能具有诊断价值。该技术的主要优势在于，组织切片在短时间内能够模拟天然组织的复杂生物学特性，包括空间分布的功能。尽管该方法可为小鼠肺癌组织切片的应用提供见解，但也适用于其他类型的组织，包括人类组织。

首先，根据说明书中的操作步骤准备振动切片机并进行 VibraCheck。然后向 24 孔板的每个孔中加入 1 毫升含有青霉素和链霉素的 Hank's 平衡盐溶液，并将该板置于冰上。将一只已处死的小鼠放置在泡沫塑料盖上，用 25 号针头插入其四只足垫，使胸部暴露并拉伸动物体。

在暴露的皮肤表面喷洒70%酒精。将剪刀呈倾斜角度放置，从腹部向胸部方向剪开皮肤，直至颈部区域。使用镊子将两侧皮肤拉伸，并插入25号针头。

切开腹部区域，然后切开肋骨和膈肌以暴露肺和心脏。通过切除周围组织暴露气管。

将肺脏与心脏一同解剖取出。将组织放入含有30毫升冰上预冷的、添加了青霉素-链霉素的HBSS溶液的50毫升离心管中，并立即尽快进行下一步操作。随后将带有肿瘤的肺组织转移至一个10厘米的组织培养皿中。

使用无菌剪刀和镊子分离肺叶，并选择表面有肿瘤的肺叶进行切片。将带有肿瘤组织的肺叶放置在滤纸上以防止滑动，然后使用无菌手术刀切除肿瘤周围的部分正常肺组织或额外的肿瘤组织，以获得一个平坦的组织切面。将平坦的一面浸入一滴氰基丙烯酸酯胶水中，然后将其固定在振动切片机的样品托上，使肿瘤朝向刀片并保持直立位置，静置干燥两到三分钟。

将振动切片机的样品架放入金属缓冲液托盘中。向托盘内加入含有青霉素-链霉素的冷HBSS，直至组织完全浸没在缓冲液中。用仪器附带的有机玻璃盖盖住缓冲液托盘，并将托盘置于白色冰浴中，加入冰块以确保切片过程中组织保持低温。

将白色冰浴槽连接至振动切片机。然后选择合适的切片参数并开始切片。将振动切片机的刀片移至切片位置，并设定切片范围。

使用无菌镊子将切片收集到24孔板中，每孔加入1毫升添加了青霉素-链霉素的HBSS，并置于冰上。在记录切片顺序的同时，根据实验方案标记24孔板的每个孔。收集与培养切片相邻的组织切片，作为零小时或未培养的对照。

至少采集三个参考切片，以代表组织的顶部、中心和底部。切片完成后，继续进行固定和处理。随后，准备六孔板，每孔加入 2.5 毫升培养基，并将钛网置于其中。

确保钛网与培养基之间无气泡形成。将脑片加载到钛网上时，将六孔板保持倾斜，使部分培养基覆盖钛网。然后将脑片置于钛网上的培养基中，并用镊子将其展开。

放置切片后，将六孔板放入置于37摄氏度、含95% O₂和5% CO₂的湿化培养箱内的旋转孵育装置上，启动旋转循环。对于长期培养，每天需更换培养基：用无菌镊子将承载组织切片的网格取出，并将其置于六孔板的空孔中，然后更换新鲜培养基。

更换70%的培养基，并重新放回网格。继续按照之前的旋转周期进行操作。对肿瘤切片进行药物处理时，向六孔板中加入2.5毫升含有稀释药物或溶剂对照的培养基。

将钛网放入孔板的孔中，然后像之前一样将切片放置在钛网上。处理24小时后，继续进行固定和后续处理。开始固定时，用镊子小心地将目标切片转移至一个10厘米的培养皿中，培养皿内放置浸有2–3 mL PBS的滤纸，让切片漂浮其上。

然后用镊子将滤纸取出，放入组织学包埋盒中。将滤纸转移至组织学包埋盒内。在组织切片上滴加一滴稀释的苏木精溶液，以标记切片位置，便于后续步骤操作。

关闭包埋盒，将其放入4%中性缓冲甲醛溶液中，在4摄氏度下固定过夜。按照实验方案所述进行包埋盒的洗涤和后续处理后，打开组织包埋盒，用手术刀小心地将固定的组织切片从滤纸上剥离。弃去滤纸，将切片转移至含有液体石蜡的模具中。

使用平底重物将组织压紧在包埋模具底部，以确保切片均匀。将组织学包埋盒的底部分置于模具上方，然后在其上添加液态石蜡。

将模具在冷板上冷却 30 分钟。随后将冷却后的模具与石蜡块分离。使用切片机对 FFPE 组织切片块进行切片，制备厚度为 4 µm 的薄片。

修剪掉组织周围多余的石蜡。为了在整个组织中获得均匀的切片，调整包埋块的角度，使其表面相对于刀片呈水平方向。使用细刷从玻片上端开始，收集石蜡包埋组织切片的连续组织切片。

继续从深层组织切片向中间层收集切片，随后收集玻片底部区域的切片。将来自每张组织切片不同层次的切片转移至载玻片，旨在捕获可能由培养诱导产生的活力梯度、细胞迁移或生物标志物表达的变化。完成切片收集后，按照本实验方案所述步骤继续进行后续处理与进一步分析。

组织切片的厚度可能影响培养切片的存活率。在此情况下，与200微米厚的切片相比，250微米厚的切片表现出更明显的坏死梯度，原因是较厚的切片更容易出现氧气或营养物质在切片内扩散不足的问题。然而，160微米的薄切片则存在较大的坏死区域，这可能是由于切片在定位过程中的技术操作所致，因为这些切片较为脆弱且容易卷曲。

对肺腺癌分化良好的标志物NKX2-1的分析显示，与0小时未培养的组织切片相比，培养后的组织切片中其表达水平未发生显著改变。对NKX2-1表达的定量分析进一步证实，培养与未培养的组织切片之间其表达水平无显著差异，表明培养过程未明显影响腺癌组织的分化状态。为了验证肿瘤组织切片是否可用于评估靶向药物的疗效，研究中将其分别用DMSO或不同浓度梯度的化合物进行处理。

当使用1 µM靶向mTOR通路的dactolisib处理时，4EBP1的磷酸化受到抑制。0.5 µM靶向MAP激酶通路的selumetinib可有效抑制ERK1/2的磷酸化。观看本视频后，您应能够充分理解如何操作并批判性分析从珍贵肿瘤组织新鲜切割的组织切片。

我们之前的博士后研究员 Katja Narhi 与 IMI Predect 联盟组织切片平台的同事们合作，为本方法的建立做出了重要贡献。