一种用于新生儿多微生物败血症的受控小鼠模型

用于多微生物脓毒症的盲肠浆液模型是解析新生儿独特病理生理机制的有力工具。该模型可能存在变异性，且人道终点描述尚不充分。本文介绍了我们高度标准化的盲肠浆液制备方法及其在实验动物中的注射操作流程。

此外，我们采用数据驱动的方法，以尽可能早地识别濒死幼鼠。首先，我们开始制备冷冻的盲肠悬液储备液。该步骤通过汇集来自至少五只成年小鼠的盲肠内容物，悬浮于无菌葡萄糖水溶液中，并于-80°C保存以备后续使用。

可以使用雄性或雌性小鼠，但实验所用小鼠的性别、年龄和背景应保持一致。首先，让我们准备好解剖所需的工具，包括用于皮肤操作的一套剪刀和镊子，以及另一套用于内脏器官操作的剪刀和镊子。

使用前至少提前30分钟打开干热灭菌器。将器械浸入70%乙醇中，然后放入干热灭菌器中加热至少1分钟。用70%乙醇喷洒一张纸巾垫，随后从灭菌器中取出器械，注意勿使已灭菌的器械部分接触到其他器械非无菌的把手部分。

将它们放在纸巾上冷却。在生物安全柜中解剖小鼠。使用23号针头将小鼠的四肢固定在泡沫板上，使小鼠腹部朝上。

用70%乙醇喷洒腹部。使用无菌镊子和剪刀剪开皮肤，用剪刀将皮肤从腹膜壁层分离，并从腹股沟至胸骨、左侧至右侧剪开一个矩形区域。清除腹膜周围的所有毛发。

更换为一套新的无菌器械，切开腹膜，同样形成一个矩形开口。辨认盲肠，其应横跨身体从左侧延伸至右侧。分离结缔组织，以确定盲肠与肠道的分支处，并将盲肠从肠道上剪下。

将其置于已灭菌的称量纸上。使用无菌工具，从盲肠两端进行切割。用镊子夹住盲肠中部，用扁平金属刮勺以滚动方式轻轻将盲肠内容物从两端推出。

收集内容物并将其放入已预称重的15毫升离心管中。最多将五只小鼠的盲肠内容物合并至同一根离心管中。待所有内容物加入后，再次称量离心管重量。

为计算每管中需加入盲肠内容物的右旋糖水体积，将该管中盲肠内容物的重量除以您期望的浓度（单位为毫克/毫升）。将一部分右旋糖水置于冰上，用于重新悬浮盲肠内容物。将所需体积的右旋糖水加入含有盲肠内容物的15毫升离心管中。

将试管垂直和水平涡旋振荡约30秒。观察是否存在直径达几毫米的颗粒物，若存在，则继续涡旋振荡，直至所有颗粒物明显消失。将一个50毫升离心管置于冰上以收集滤液，并在管口安装无菌的70微米细胞滤筛。

从一个15毫升离心管中吸取4毫升重悬的浆液，通过细胞滤筛转移至收集管中。用移液器上下吹打2到3次，重新悬浮颗粒物。在用移液器枪头搅拌内容物的同时，轻轻挤出气泡以提高过滤速度，直至无液体继续滤过。

此步骤大约需要30秒。每次更换结肠匀浆管时应更换细胞滤筛，但将所有滤过物收集至同一个50毫升收集管中。如果您的原液体积超过40毫升，则涡旋震荡15秒，并将20毫升转移至新的离心管中。

将悬液分装至冻存管中，每管500微升。每分装三管后，涡旋混匀悬液一次。将主液置于冰上保存于冻存管中。

将等份样品在零下80摄氏度保存，盲肠悬液制备物中的需氧菌落形成单位浓度在六个月内不会发生变化。现在盲肠悬液已制备完成，我们可以使用该悬液对7至8日龄的幼鼠进行接种，接种剂量根据体重进行调整。该悬液的致死率具有剂量依赖性。

您需要针对每个新的菌株，通过新的剂量滴定，在您的实验场所确定所需的致死剂量。每窝动物制备一份盲肠匀浆注射分装样品。我们将接种物标准化为100微升体积，并为同窝中的每只动物将体积四舍五入至最接近的10微升。

准备挑战剂量分装液需要进行三项计算：所需混悬液原液的体积、所需添加的葡萄糖水体积，以及每只仔鼠的四舍五入后给药体积。各项计算的具体方法详见方案第三部分。每次实验均手动计算这些数值不仅耗时，还可能引入实验误差；因此，可随方案一同下载一个电子表格工具，您只需输入原液浓度、目标剂量以及整窝仔鼠的总重量，表格将自动计算出所需混悬液原液量、葡萄糖水添加体积，以及每只仔鼠的实际给药体积。

您可以打印此工作表，并在准备对动物进行实验时随身携带。在生物安全柜中配制注射用分装液，并将其置于冰上保存。在将溶液装入注射器之前，通过轻轻弹击微量离心管20次以充分混匀。

使用28号针头的胰岛素注射器对幼鼠进行攻毒。在抽取悬液前，通过将攻毒 aliquot 在微量离心管中反复吸入和推出300至500微升来充分混匀。然后，吸取约150微升的攻毒 aliquot。

注射器的容量应大于任何7至8日龄幼鼠的注射体积。轻弹注射器，使气泡从推杆处脱离，并轻微回拉注射器以排出所有气泡。在此过程中，切勿触碰针头或推杆杆部。

将多余的盲肠悬液重新注入微量离心管中，直至注射器中装入计算好用于小鼠的盲肠悬液量。通过腹腔注射给予盲肠悬液。请依照贵机构动物护理部门的实验方案进行操作。

为尽量减少渗漏，将幼鼠倾斜使其朝下，将针头插入腿部与生殖器之间的位置，保持针头浅层且位于皮下。插入针头约一厘米后，向下并向内按压，直至感觉到针头刺破腹膜，然后缓慢推动推杆。沿原路径小心拔出针头，同时放松中指。

在实验记录本中记录任何泄漏情况，并考虑将存在明显泄漏的动物从最终结果中剔除。在本节中，我们将概述在经多微生物脓毒症攻击的小鼠中观察到的不同健康状况及其相应的仁慈终点。对于涉及新生小鼠的任何操作，我们将垫料转移至新笼中。

这会将母鼠的气味转移到手套上，减少因反复进入笼子而给母鼠带来的应激。我们在新笼中再建一个巢，用于暂时安置被监测的幼鼠，直到操作或监测结束，整窝幼鼠可以被放回母鼠笼中。将小鼠仰卧放置，并观察其是否能在四秒内恢复正常体位。

如果能够翻身，则再等待八秒以确定其活动能力水平。未受刺激或正在恢复的小鼠通常能够翻身，并通过连续迈出多步来探索周围环境。将能够自行翻身并迈出几步以探索其环境的小鼠归为“可翻身-迟钝”类别。

这些小鼠在迈步时可能会跌倒，站立时显得摇晃不稳。若一只小鼠无法自行恢复直立姿势，且其髋部活动范围超过水平方向90度，则将其归为“无法复位-可移动”类别。此类小鼠最终能够恢复直立，但在四秒内无法完成。

由于其髋部运动，该小鼠被归类为“翻正失败-活动型”。若幼鼠无法完成翻正动作，且其髋部运动幅度低于水平方向90度，则被归类为“翻正失败-迟钝型”。这是另一只髋部活动未超过水平方向90度的小鼠，因此被归类为“翻正失败-迟钝型”。

无法向右转的非活动性幼鼠，其腿部可能会抖动或震颤，但无髋部运动。四肢可伸展和回缩，但无侧向运动。该幼鼠明显患病，已达到人道终点。

这是另一例无法向右非移动性幼崽的例子。它的臀部不会左右晃动，但其爪子会颤动。在处理母鼠笼子时，如果哺乳期母鼠跑动，幼崽可能会被拖出巢穴。

我们会将这些小鼠替换，然后检查是否有其他脱离巢穴同伴的散落幼鼠。如果这些散落的幼鼠无法恢复正常体位或表现出嗜睡状态，则已达到人道终点。以下是我们脓毒症模型的Kaplan-Meier生存曲线。

监测时间点详见所附的标准操作程序（SOP）。在生存曲线的任何时间点，若发现小鼠无法自主恢复直立且无活动能力，则视为达到人道终点，需实施安乐死。在攻毒后12至21小时之间，小鼠会出现疾病症状，约一半小鼠能够向一侧翻正，而另一半则无法向任一侧翻正。

在此时间段内，小鼠的健康评分将开始下降，并达到“无法翻身且不活动”的人道终点。以下是此时间段内观察到的健康评分的代表性结果。此时，尚无法根据健康评分区分存活组与非存活组。

在疾病这一阶段（攻毒后21至48小时），我们观察到人道终点的比例最高。我们还发现，绝大多数无法在两侧自行翻身的小鼠最终将无法从疾病中恢复，因此这成为除“无法翻身且无活动能力”标准之外新增的人道终点判断标准。在此疾病阶段观察到的健康评分能够有效区分存活者与非存活者。

绝大多数在两侧均无法恢复正常体位的小鼠均未能从疾病中恢复。该数据支持将人道终点的新标准设定为：在攻毒后21小时开始，对任何在两侧均无法恢复正常体位的小鼠实施安乐死。攻毒48小时后，许多小鼠将开始表现出更多的活动以及更佳的翻正反射。

尽管在此期间人道终点的比例较低，小鼠仍可能病情恶化并变得更加虚弱，因此仍需对其进行人道终点的监测。在此时间段内，部分最终被归为非存活组的小鼠曾一度表现出活动增加，但随后病情加重并达到人道终点。这提示，若患病动物开始出现更差的健康状况，必须增加监测频率，持续密切观察。

在未接受过现场培训、仅观看本教学视频的情况下，独立实验人员通过观看录制的测试视频，对其能否与研究人员给出相同评分的能力进行了测试。本教学视频可实现准确的行为学分类。在60只新生小鼠中评估了对“失败-正确-无活动”新生小鼠进行正确评分的能力（该指标用于衡量人道终点），结果平均有97%的行为被准确区分，仅有3%被误判。

接下来，检测了新生小鼠在四秒内无法恢复直立或能够恢复直立的能力。这是评估人道终点的另一项指标，在97%的新生小鼠中被准确判定，而3%的幼鼠被错误地判定为能够恢复直立。以下是小鼠相对于攻击时间的体重变化百分比的代表性结果。

在攻毒后24小时，存活组与非存活组之间的平均体重变化开始出现差异，但两组之间仍存在较大重叠。部分存活小鼠的体重减轻超过20%，但仍能从疾病中恢复。相比健康评分的差异，体重变化在预测结局方面效率较低，因此不作为判断小鼠是否达到人道终点的标准依据。

总之，您现在应该能够制备一批冷冻的盲肠匀浆，计算按体重调整的剂量，并对新生小鼠进行注射和监测，以观察人道终点。我们希望这将为您的小鼠研究提供有价值的帮助。