一种用于免疫细胞分析的坏死性小肠结肠炎新生小鼠模型及固有层分离方法

我们的研究聚焦于一种影响医学上脆弱婴儿的疾病——坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）。我们旨在揭示NEC中免疫反应的相关机制，并开发该疾病的早期诊断与预防策略。研究新生儿NEC中肠道免疫细胞反应极具挑战性。本方案通过展示如何分离固有层免疫细胞并利用流式细胞术进行分析，填补了这一技术空白。

首先，获取一株从患有全结肠坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis totalis，NEC）的婴儿体内分离培养的肠道细菌。在实验第0天下午3:00，用移液器将20 µL该菌液转移至含有2 mL LB肉汤（Luria-Bertani broth）的15 mL培养管中。将细菌培养物置于37°C条件下，在设定为1G的旋转摇床中振荡培养16小时，确保培养管盖处于通风位置。

同时，将另一支仅含2毫升LB肉汤的培养管作为对照组进行孵育，以检测是否存在任何污染。次日早上7:00，将125微升过夜培养的细菌培养物移入一个带有透气盖的T75细胞培养瓶中，瓶内含25毫升LB肉汤。共准备四份T75培养瓶，并于37°C条件下在设定为1G的轨道摇床中直立孵育两小时。

在实验第1、2、3天上午9:00，将16毫升婴儿配方奶粉与8毫升幼犬奶在无菌的50毫升离心管中混合，制备配方混合液。去除两个含有菌体沉淀的50毫升离心管中的上清液。将每个沉淀物用2毫升制备好的配方混合液充分重悬。

然后将两种重悬后的混合物转移至剩余的配方混合液中，配制成总量为 24 毫升的 NEC 配方。用六个喂养时间点标记六个 50 毫升离心管。将 4 毫升 NEC 配方分别移液至六个已标记的离心管中。

接下来，准备六份脂多糖储备液，每份均为单次使用量，浓度为5毫克/毫升，并将其储存于低吸附性微量离心管中，置于20摄氏度保存。喂养前立即取出一份脂多糖溶液解冻，并涡旋振荡15秒。根据计算量取适量脂多糖溶液加入4毫升坏死性小肠结肠炎配方管中，用移液器充分混匀。

用1毫升注射器吸取配制好的NEC配方，并将其连接至新生儿PICC导管。通过口服灌胃法将NEC配方给予每只幼鼠时，应轻轻抓住幼鼠颈部基部的松弛皮肤，使其保持直立。PICC导管的插入距离等于从口角至胃部乳斑顶端的距离。

应使用永久性记号笔在经外周静脉置入中心静脉导管（PICC）管线上标记最佳插入位置。使用镊子将PICC管线引导进入咽部，并向下送入胃内。若遇到阻力，应撤出PICC管线，重新调整位置后再次尝试插入。

缓慢将80微升的NEC配方液注入胃内。喂养期间监测幼崽是否有误吸迹象。喂养结束后，拔除经外周静脉置入中心静脉导管（PICC）并观察幼崽是否出现呼吸困难或呕吐。

若发生反流，使用低绒毛实验室擦拭纸轻拭幼崽的口鼻。在每次喂养时间点重复喂养过程。在实验第4天，采集经安乐死处理的新生小鼠的肠道组织。

用剪刀将肠道纵向剪开，随后横向切成1-1.5厘米长的节段。将肠段转移至含有10毫升预消化液的15毫升离心管中，预消化液需预先在冰上冷却。然后在37摄氏度下以持续旋转的方式孵育20分钟，以开始组织解离。

轻轻涡旋离心管以使松动的组织脱落，然后将内容物倒入置于50毫升离心管上方的100微米细胞滤筛中。将剩余的组织碎片转移至一个新的含有10毫升预热至37摄氏度消化液的15毫升离心管中。在37摄氏度下，以持续旋转方式孵育样品40分钟。

然后将内容转移至自动组织解离管中。运行程序，进行四次交替的顺时针和逆时针旋转循环，每次旋转15秒。当组织解离完成后，轻轻涡旋振荡解离管中的细胞悬液，随后在4摄氏度下以300G离心5分钟。

小心吸除上清液，避免扰动沉淀。将细胞重悬于1毫升预冷的荧光激活细胞分选缓冲液中。在50毫升离心管上放置一个100微米的细胞筛网。

将重悬的细胞通过滤网转移，并用2毫升冷的荧光激活细胞分选缓冲液洗涤。计数分离的细胞，并使用台盼蓝或活率染料评估细胞活力。在4摄氏度下，以300×g离心5分钟，沉淀用于流式细胞术的所需体积细胞。

与母乳喂养的对照组相比，NEC治疗组的存活率显著降低。对NEC小鼠的肠道大体检查显示了NEC的典型特征，包括明显的肠管扩张、气体积聚和肠壁积气，而健康对照组则无此类表现。苏木精和伊红染色显示，与对照组结构完整的绒毛相比，NEC小鼠出现片状绒毛破坏及肠道结构紊乱。

NEC组中IL1B、CXCL2和LCN2信使RNA的表达水平显著高于对照组。NEC组与对照组之间，肠道固有层中总CD45+免疫细胞数量无显著差异。与对照组相比，NEC肠道中的巨噬细胞水平显著升高。

与其它免疫亚型相比，NEC 小鼠的髓系细胞比例升高，尤其是单核细胞和巨噬细胞。单细胞多组学方法正在揭示 NEC 中免疫细胞的特征，为疾病机制和潜在生物标志物提供新的见解。由于 NEC 是一种多因素疾病，其建模具有挑战性。

在新生小鼠中复制人类肠道环境、免疫反应及微生物影响需要精细优化。我们的模型整合了人源微生物组、低氧环境和配方喂养，使其在新生小鼠中具有生理相关性，适用于详细的免疫细胞谱型分析。