利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学 黑腹果蝇 卵室

本方案有助于科学家在单个上皮细胞中分析亚细胞肌动肌球蛋白网络，同时也可在弯曲的上皮组织中进行多细胞尺度的类似分析。本方案是 Fiji 软件应用的一个良好范例，具有直观的图形用户界面，且无需任何脚本编写知识。

因此，该方法也十分适用于该领域的初学者。尽管我们的方法是针对果蝇卵室开发的，但也可应用于果蝇上皮以外的体系。我们鼓励科研人员在各自的研究模型中尝试使用我们的实验方案。

使用附带的测试文件来熟悉本实验方案。这将帮助您确定本方案的哪一部分适用于您的具体研究问题。本方案的这一部分允许用户在延时成像视频中对上皮细胞进行分割，随后利用表面管理器（Surface Manager）对单个细胞随时间变化的肌动球蛋白脉冲进行分析。

首先，打开 Fiji，按照随附的文字方案所述导入宏文件 TissueCellSegmentMovie.ijm。然后，打开一个经过漂白校正的 TIFF 文件，并通过菜单栏依次选择图像（Image）、颜色（Color），再选择拆分通道（Split Channels），将该漂白校正后的文件的通道进行拆分。

通过点击已打开脚本中的“运行”图标，将上传的脚本应用于所选延时电影的活性细胞膜通道。为了获得理想的细胞掩膜，将高斯模糊设置为 2.500，细胞检测灵敏度设置为 -1，然后点击“确定”。接着，对于使用 63x 物镜采集的延时电影，将估计的噪声容差设置在 10 到 20 之间，然后点击“确定”。在分析后的延时电影中会出现生成的细胞掩膜，同时会弹出一个名为 ParticleStack 的新窗口，以及一个名为“操作要求”的小窗口。根据延时电影中的细胞掩膜，仅关注位于中央区域的细胞，并选择在整个延时序列中能够提供完整且轮廓清晰的细胞。

当中心选定的细胞与真实的细胞膜良好对应时，将 ParticleStack 另存为 TIFF 文件。在 Fiji 中打开相应的 ParticleStack TIFF 文件。在 Fiji 中安装了 Surface Manager 插件后，打开该插件。

在表面管理器中，单击“读取轮廓图像”按钮，并将雅卡尔指数设置为 60%。加载轮廓可能需要几分钟时间，具体时长取决于细胞数量。加载完成后，每个细胞将被分配一个 S 编号，并显示在表面管理器窗口的左侧部分。单击选定的 S 编号，以选中来自 ParticleStack1 的已导入细胞轮廓。

在延时电影中会出现 tiff。检查每个导入的 S 编号在整个电影中的细胞轮廓质量，并删除显示不正确细胞轮廓的不需要的细胞。要删除不需要的细胞，请突出显示细胞轮廓，然后点击删除按钮。

使用画笔工具校正细胞轮廓。完成后，将校正后的细胞保存为 RoiSet.zip 文件。

为了确定所分析的组织中是否存在肌动球蛋白脉冲，并了解肌动球蛋白信号的详细行为及其方向性，首先打开 Fiji。打开一个延时成像视频，加载已保存的 ParticleStack1.tiff 细胞掩膜和经过漂白校正的延时成像视频，然后加载 Surface Manager 插件以及来自 RoiSet 的相应感兴趣区域。

压缩文件。接下来，在表面管理器中，激活包含感兴趣信号的通道。单击“统计”按钮，打开名为“逐层平均灰度值”的窗口。

肌动球蛋白信号的平均值和中位强度将随时间以任意单位显示，同时还会显示与细胞面积和形态相关的其他参数。通过进入统计窗口，点击文件，然后选择“另存为”，将这些数值保存为电子表格文件。类似地，生成细胞掩膜并将其载入表面管理器，以在组织尺度上分析肌动球蛋白脉冲。本实验方案部分允许用户随时间选择性地提取弯曲上皮组织中的一层薄层肌动球蛋白。

这些步骤操作简便，基于直观的图形界面。打开 Fiji 软件，并确保已安装 Ellipsoid Surface Projection 插件。然后打开一个延时成像视频，依次点击 Plugins → BigDataViewer，选择 Export Current Image as XML/HDF5 file，将其导出为 XML/HDF5 文件。

接下来，在“椭球体表面投影”中打开导出的文件：依次点击插件（Plugins），选择 BigDataViewer，然后点击椭球体表面投影（Ellipsoid Surface Projection），并选择 XML 文件。这将打开一个显示卵室矢状面视图的新窗口，同时会出现一个引导用户完成处理流程的对话框。该名为“卵巢投影”（Ovaries Projection）的对话框包含多个选项卡。

在名为“边界框”的第一个对话框选项卡中，定义延时录像中卵室的 x 和 y 边界，以及边界框的 z 轴宽度，然后点击“设置”。卵室被选中的部分将以粉红色高亮显示。接下来，在“卵巢投影”窗口中名为“查找斑点”的对话框选项卡中，定义信号斑点的大小。

设定sigma值和最小峰强度值，然后点击“计算”以识别肌动球蛋白信号，这些信号将显示为绿色斑点。请使用不同的参数重复此步骤，直到找到约100个斑点为止。

确定肌动球蛋白信号是至关重要的一步。该步骤依赖于信号的质量以及所检测到的斑点的正确大小。如果图像中没有可见的绿色斑点，则下一步将无法进行。

为了设计椭球体，请继续选择名为“fit ellipsoid”的选项卡。将随机采样数设置为 10,000，内外截断距离设置为 1 到 10，然后点击计算。完成此操作后，“projection”选项卡将自动打开，并允许定义表面提取。

在投影选项卡中，将最小和最大投影距离设置为所需椭球体的宽度。最小和最大投影距离必须合适，以确保粉红色定义的椭球区域包含卵室的整个外层。然后，将切片距离定义为1。

在点击计算之前，请确保卵室上已定义的椭球体的粉红色区域可见。这有助于评估新椭球体拟合的质量。接下来，将椭球体的输出宽度设置为大于或等于800，高度设置为大于或等于400。

然后，设置表面提取的持续时间，并选择球面或柱面投影。如有需要，翻转Z轴并调整Y轴对齐。点击“计算”按钮，将在名为“image”的新窗口中获得两个通道的表面提取结果。通过点击“图像”，进入“调整”菜单并选择“亮度/对比度”，调节所得图像窗口的亮度和对比度，以便观察投影的肌动球蛋白信号。

如果表面提取效果良好，将两个通道分别保存为 TIFF 文件。此外，将日志窗口文件保存下来，以便日后参考该特定卵室表面的提取过程。然后，在 Fiji 中使用首选的颜色编码合并通道，并将结果保存为 TIFF 文件。

本方案使科学家能够研究上皮组织中肌动球蛋白网络的行为。只有将局部细胞尺度上对肌动球蛋白行为的详细分析与组织尺度上的类似分析相结合，才可能实现这一目标。图中展示了对照组和fat2突变型果蝇卵室在局部细胞尺度和组织尺度上肌球蛋白II动态行为的代表性示例。

在基底单层平面上，对照组卵室中肌球蛋白II的绿色修饰型调节轻链信号沿前后轴垂直方向移动。这种极性在fat2突变型卵室中丧失，导致肌球蛋白II出现各向异性的脉冲和振荡。在组织层面，对照样品中肌球蛋白II的绿色修饰型调节轻链产生同步的收缩力，从而促进上皮层旋转。相比之下，fat2突变型卵室的滤泡上皮在基底侧强烈脉冲，却无法产生促进上皮层旋转所需的同步收缩力。

在果蝇卵室的顶端狭窄区域，fat2 突变体也表现出肌球蛋白 II 的绿色修饰型调节轻链的动态行为发生改变。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何使用 Fiji 软件在果蝇卵室中对肌动球蛋白网络在局部和组织尺度上进行分析。有关更多实用技巧和故障排除方法，请参见实验方案后的讨论部分。如果您对 Fiji 或我们的插件有任何疑问，请访问相应的网页或与我们联系。