利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

该方法可以解答力学生物学领域的一些关键问题，例如力如何在细胞内以及细胞与其环境之间传递和感知。该技术的主要优势在于，它能够获取有关蛋白质在活细胞天然环境中响应机械力的分子尺度信息。尽管该方法已专门用于研究局灶性黏附蛋白vinculin，但也可应用于其他对机械力敏感的蛋白质，例如talin、cadherins或nesprin。

该方法的可视化演示至关重要，因为正确的成像设置虽具挑战性，但对分析成功十分必要。首先，按照文本方案中的详细说明，在目标细胞类型中稳定表达张力传感器构建体。为准备用于接种细胞的基底，需准备四个35毫米玻璃底培养皿。

在细胞培养超净台中，于15毫升锥形管内配制4毫升浓度为10微克/毫升的纤连蛋白（fibronectin）无菌磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。轻轻倒置混匀一次，于细胞培养超净台中静置5分钟。随后，将1毫升纤连蛋白溶液加入每个玻璃底培养皿中。

将纤连蛋白溶液在室温下孵育一小时，或在 4°C 过夜。然后吸除纤连蛋白溶液，并用 PBS 洗涤一次。在培养皿中保留 1 mL PBS，直至细胞准备接种。

计数细胞后，将30,000个细胞接种至每孔含纤维连接蛋白包被的玻璃培养皿中，加入适量的完全培养基，终体积为1.5毫升。接种后让细胞贴壁伸展4小时。在细胞贴壁2小时时，吸除生长培养基，并用成像培养基冲洗一次。

留下 1.5 毫升成像培养基。在开始校准之前，按照文本方案中的描述预热显微镜。为了校准 FRAP 激光，首先打开激光配置窗口。

将照明设置调整为适合样品激光曝光的相应FRAP照明设置。然后将照明设置调整为仅对受体荧光染料成像的合适照明条件。在坐标系设置下选择需要校准的物镜。

取消勾选“手动单击校准点”，勾选“校准期间显示图像”。将停留时间设置为 10,000 微秒，脉冲次数设置为 100。现在将校准载玻片（由溴化乙锭密封在载玻片与盖玻片之间制成）放入载物台适配器中，盖玻片一侧朝下。

使用受体照明设置聚焦于载玻片表面，该表面可识别为具有最亮信号的焦平面。涂层中的微小缺陷将可见，有助于聚焦。移动载玻片至成像平面内荧光均匀的区域。

首次校准时点击“创建设置”，后续校准则点击“更新设置”。软件将启动校准程序，自动进行漂白并检测漂白点的位置。通过评估最终图像来确保校准成功，最终图像应为一个3×3的漂白点阵列，各点应分布均匀且聚焦清晰。

将校准图像保存以供日后参考。取下校准载玻片并妥善保存。每次实验开始前应进行校准，但样品之间无需重复校准。

准备用于活细胞成像的显微镜系统，最好配备加热载物台和物镜，以及二氧化碳控制装置。平衡系统20分钟。随后将表达张力传感器的细胞样本之一放入显微镜样品 holder 中进行成像。

让细胞平衡10分钟。为确保成像细胞的健康状态，需在成像腔室内维持37摄氏度的温度。使用蠕动泵以每分钟15毫升的流速向样品通入加湿的5%二氧化碳，以维持pH值。

打开多维采集（Multi-Dimensional Acquisition，MDA）工具，使用FRET成像参数（包括不同的滤光片组）进行设置。将此MDA以“MDA_FRET_日期”为名称保存至实验文件夹中。再设置另一个包含FRAP成像参数的MDA，包括不同的滤光片组、时间序列设置，以及在预漂白采集后通过Journal程序触发激光脉冲的设置。

将此 MDA 保存到实验文件夹中，命名为 MDA_FRAP_日期。在屏幕顶部的工具栏中，选择“Journal”（日志），然后点击“Start Recording”（开始记录）。打开 MDA 窗口，加载 MDA_FRET_日期 状态，然后点击“Acquire”（采集）。

然后加载 MDA_FRAP_date 状态并点击采集。采集结束后，在屏幕顶部的工具栏中选择“日志”->“停止记录”。将此日志保存到实验文件夹中，命名为 FRETFRAP_date，并将其添加到工具栏以便快速访问。

关闭 MDA 窗口。在“采集”下的图像采集界面中导航样本，以最短曝光时间并结合中性密度滤光片进行采集，以识别目标细胞。通过进入“设备”中的“聚焦”来设置连续自动聚焦。

手动调节焦距，直至到达正确的成像平面。点击“设置连续对焦”，并等待系统进行调整。系统调整完成后，点击“开始连续对焦”。

然后寻找一个张力传感器在目标结构上定位清晰的细胞，并拍摄一张图像。绘制一个矩形感兴趣区域（ROI），以标示漂白的位置。保存该 ROI 的位置。

现在初始化 FRETFRAP_date 期刊，这将开始采集 FRET 图像，随后初始化 FRAP 时间序列。重复这些步骤，直到获得 10 到 15 组图像。然后按照文本方案中详述的方法分析 FRET-FRAP 数据。

此处展示的是在对黏着斑进行分割和掩膜以分离后，对纽蛋白张力传感器进行FRET成像的代表性结果。可在细胞内观察到纽蛋白受力的空間分布差异。FRAP成像与分析可能受到黏着斑稳定性的影响。

在成像期间快速移动的黏着斑可能难以准确追踪。这种情况通常表现为荧光漂白后恢复（FRAP）曲线中存在不连续性，导致曲线无法解读。对于野生型纽蛋白（vinculin），蛋白负荷与周转速率之间存在负相关关系，表明纽蛋白可被机械力稳定。

在纽蛋白（vinculin）中引入突变以影响其与踝蛋白（talin）的结合，会导致相关性发生逆转，表明无法与踝蛋白结合的纽蛋白会因受力而变得不稳定。在进行该操作时，需注意正确制备样品，确保细胞以内源性水平表达传感器，并谨慎选择成像参数。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如免疫荧光、测量细胞尺度动态变化，或使用不同抑制剂处理细胞，以回答更多问题，例如目标蛋白如何与其他亚细胞组分相互作用以协调对力学刺激的响应。