荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

本实验的总体目标是同时测量受体样结合，并在单细胞水平上观察结合诱导的钙信号转导。该目标通过以下步骤实现：首先分离生物素并调节人红细胞（RBCs）的渗透压，以将其用作超灵敏的力传感器；第二步是功能化微米级玻璃珠，包括清洗、扩张和配体包被。

接下来，分离T细胞并用钙离子荧光染料Fluo-2 AM孵育，以实现对细胞内钙离子浓度的观测。最后一步是准备实验腔室中的微移液管，这些微移液管为实验装置所特需。最终，采用荧光生物膜力探针（BFP）技术，以展示细胞与配体包被微球之间的黏附作用，测量受体-配体结合动力学，同时监测细胞内钙离子水平。

该技术有助于理解T细胞如何通过雄激素识别感知机械力。与现有方法相比，该技术的主要优势在于FBIP能够同时测量受体-配体结合动力学和细胞内信号传导。本实验方案的难点包括手动制备直径合适的微 pep 通路、使用微 PEP 捕获细胞和蜜蜂，以及组装力探针，这些步骤在初次尝试时可能失败，尽管他无法出席本视频的演示。

共同作者 Arnold G 在我的实验室最近完成了博士学位，对 FBAP 方案的初始制备验证做出了重要贡献。从指尖采血 8 至 10 微升，加入 1 毫升碳酸氢盐缓冲液中，涡旋混匀或用移液器吹打混合，然后在 900 ×g 条件下离心 1 分钟。弃去上清液后，用碳酸氢盐缓冲液再洗涤一次。

接下来，取10 µL红细胞压积与171 µL碳酸氢盐缓冲液及1049 µL生物素-PEG-NHS交联剂溶液混合，室温孵育30分钟。采用与之前相同的洗涤步骤，先用碳酸氢盐缓冲液洗涤所得红细胞混合物一次，再用N2 5%缓冲液洗涤两次。

接下来将制霉菌素稀释到 N2 5% 缓冲液中。为配制终浓度为每毫升 40 微升的溶液，取 5 微升生物素化红细胞与 71.4 微升制霉菌素溶液混合，并在 0 摄氏度下孵育 1 小时。最后，用 N2 5% 缓冲液洗涤样品两次，将生物素化红细胞重悬于含 0.5% BSA 的 N2 5% 缓冲液中，置于冰箱中保存。将一段三英寸的微毛细管安装到微电极拉制仪上。

点击拉制按钮，使毛细管中部被仪器加热，同时两端被拉伸，形成两根具有尖端的毛细管，即为原始移液管。随后将原始移液管安装到显微移液管拉制仪的移液管 holder 上，使用加热炉加热以熔化玻璃小球。将原始移液管的尖端插入玻璃小球内部。

冷却玻璃球，然后从外部拉动毛细管使其断裂，将管尖留在球内。重复此操作，直至获得所需孔径的管尖。首先使用玻璃切割器将40毫米×22毫米×0.2毫米的盖玻片切割成两块40毫米×11毫米×0.2毫米的片状。细胞腔室构建在一个自制腔室支架的基础上，该支架由两个金属方块和连接它们的手柄组成。

用胶水将一片盖玻片粘在腔室支架的底面，使其覆盖并连接两个金属方块。同样，将另一片盖玻片粘在顶面，从而形成一个平行盖玻片细胞腔室。接着，使用移液器在两片盖玻片之间注入 200 µL 实验缓冲液。

确保缓冲液与两张盖玻片均接触。轻轻旋转并晃动样品室，使缓冲液接触样品室两端。然后小心地将石蜡油注入样品室两侧，位于实验缓冲区的两侧，从而将缓冲液与空气隔绝密封。

注射含有益生菌的悬浮液。微珠、条形码和靶标分别位于缓冲区的上部、中部和下部区域。开始进行BFP实验时，打开显微镜和光源。

将腔室放置在显微镜主载物台上。下一步是安装BFP的全部三根微移液管。左侧的探针用于抓取一个红细胞。

右侧的目标是抓取细胞，右下方的辅助装置用于抓取微珠进行安装。使用显微注射仪将实验缓冲液回填至显微移液管中。将显微移液管从移液管架上取下，并将其置于较低位置，使液体从尖端滴下。迅速将显微移液管插入持针器尖端，确保无气泡进入显微移液管内。

插入过程中，拧紧固定螺钉，然后将每个移液器固定器安装到对应的显微操作器上。推动微移液管朝向记录室，使其尖端进入记录室的缓冲区域。调整微移液管的位置，并在显微镜视野下找到它们。

移动腔室支架载物台，找到三种组分的集落。逐一旋转操纵器上的旋钮，调节相应微量移液管的位置，使微量移液管的尖端靠近一个细胞或微珠，吸取该细胞或微珠。通过调节相应微量移液管内部的压力，使三根微量移液管分别捕获对应的组分。

移动载物台上的腔室支架，找到一个远离已注射元素菌落的空白区域，用于进行实验。切换显微镜的观察模式，以便在计算机程序中查看图像。将移液器尖端上的三个元素全部移入程序的视野范围内。

接下来，对准探针珠和红细胞，小心地将探针珠移动至红细胞的顶端。短暂地将珠子轻触红细胞，然后轻轻回撤，调整辅助微移液管的压力，轻柔地将珠子吹离，使其粘附在红细胞的顶端。移开辅助移液管，并在程序中对准目标和探针珠。

在视野窗口中，使用程序工具测量探针微移液管、红细胞以及红细胞与探针微珠之间圆形接触区域的相应半径。这些数值可用于估算红细胞的弹簧常数，估算方法见文本方案中列出的公式。将所需的红细胞弹簧常数输入程序后，在红细胞顶点处绘制一条水平线，相邻窗口将显示一条曲线，表示每个像素的亮度。

沿此方向，将阈值线拖动至曲线深度的大约一半位置。接下来，选择所需的实验模式：热波动测定黏附频率实验、黏附频率测定实验或力钳实验。根据需要设置参数。

单击“开始”，程序将控制目标移液管移动，并驱动目标与探针接触和分离，同时并行执行数据采集，实时记录探针微珠的位置。单击“停止实验”按钮以终止程序，此时将弹出一个窗口。为保存采集到的数据，请启用BFP系统的荧光功能，打开由独立程序控制的激发光源和荧光相机。

然后选择荧光成像的参数，包括增益、曝光和激发通道。按照BFP实验方案中的所有准备步骤操作，包括对准探针与目标，以便观察到由340纳米或380纳米激发光激发的目标细胞的活体荧光图像。使用切片工具大致划分出细胞在整个记录期间将保持在内的区域。

接下来，同时点击“记录”并开始点击。“记录”功能允许340纳米和380纳米的光交替激发细胞内荧光染料，每秒大约交替记录一对相应的荧光图像。

单击“开始”将启动BFP实验，用于分析分子相互作用，同时启动荧光成像实验以监测细胞内钙信号，并按照文本方案所述步骤进行数据分析。在力-时间原始数据曲线中，力的数值是通过追踪探针微珠位置变化获得的。在无黏附事件中，当靶细胞从微珠表面回缩后，力-时间反向信号中的力将回到零值。

相反，在断裂力事件中，黏附会在撤回过程中表现为力迅速上升至正值，随后迅速下降回零。在寿命事件中，正向力会被钳制，形成一个平台期，该平台期的长度即为寿命。

通过重复进行VFP实验循环，将获得一条力-时间曲线。图中显示的是在340纳米和380纳米光通道激发下，少数或两个负载T细胞的荧光图像。两幅图像均显示出细胞清晰的轮廓，表明细胞染色良好。在从一个T细胞获得结合动力学数据和荧光数据后，累积寿命曲线和钙离子水平曲线将在同一图中呈现，以分析二者之间的相关性。

现在您应该已经充分了解如何进行A-F-B-I-P实验。在该实验过程中，务必注意检查力探针是否存在任何缺陷，例如微移液管的直径、橡胶细胞突起的长度以及微珠的位置。

所有这些因素都将影响力测量的准确性。该技术为分子力学生物学领域的研究人员探索各种可能的生物系统中机械转导的机制铺平了道路。