通过嵌合蛋白构建鉴定功能蛋白区域

通过交换结构相似蛋白质的区域来构建嵌合体，可帮助我们研究分子中负责生物学功能的区域的重要性。区域交换能够保留蛋白质的整体二级结构，从而区分出对整体结构起重要作用的区域与直接介导生物学功能的区域。然而，选择需要替换的具体区域可能具有挑战性。

从较大的交换片段开始通常有助于确定目标蛋白的关键功能。开始实验时，选择一种合适的蛋白质作为供体，与目标蛋白进行区域交换，具体操作详见文本方案。然后，通过访问 ref seq 网页中的基因部分，从参考序列数据库中获取受体蛋白和供体蛋白的蛋白质氨基酸序列。

在搜索框中输入目标蛋白的名称，然后点击搜索。在结果列表中，点击所需物种的基因名称。向下滚动至 ref seq 部分，查看所有已记录的亚型。

单击目标同工型的序列标识符。向下滚动并单击 cds 以高亮显示基因的蛋白质编码区。在屏幕右下角，单击 FAFSDA 并复制基因序列。

使用合适的DNA编辑软件保存DNA序列。当使用免费的APE软件时，打开程序，将复制的序列粘贴到空白框中，选择序列名称，然后点击保存。接下来，通过首先将目标蛋白质序列划分为不同的结构区域，来选择在不同嵌合体构建体中需要替换的蛋白质区域。

为此，请从 PDBe 网站下载目标蛋白的结构数据。访问该蛋白的 PDBe 页面，通过点击屏幕右侧的“下载”按钮获取 PDBe 文件。在分子可视化系统（如 Pymol）中打开该 PDBe 文件。

在 PyMOL 中显示核苷酸序列，隐藏默认的结构数据，并选择卡通视图以清晰地观察蛋白质的结构特征。点击屏幕顶部的核苷酸序列，以高亮显示分子的不同部分，并注意每个独特结构特征所对应的氨基酸。接着，在 APE 中打开 DNA 序列，选择该序列，点击“ORFs Translate”以翻译开放阅读框，然后点击第一个区域的最后一个氨基酸，以在 DNA 序列中高亮其位置，并选择该区域所对应的编码核苷酸。

右键单击所选区域，选择“新建特征”以命名并为其指定颜色。对上一步中识别出的每个结构区域重复此过程。为对齐两种蛋白质的残基序列，首先在 APE 中获取供体和受体蛋白质的完整氨基酸序列。

与之前相同，打开供体DNA序列，选中该序列，然后点击ORFs翻译。接着，访问Clustal Omega网页，输入两种蛋白质的氨基酸序列。每条序列前应有一行以蛋白质名称命名的文本，以便正确识别。

向下滚动并点击提交。通过点击“下载比对文件”标签获取比对文件并保存。该文件可由任意文本编辑程序打开。

以比对文件为参考，标注供体蛋白在DNA序列中对应的结构区域。复制受体蛋白的注释DNA序列，并将其重命名为嵌合蛋白。在APE中打开重命名后的DNA序列。

选择供体蛋白中需要替换的区域，然后选择重命名后的受体蛋白中的对应区域。粘贴供体蛋白的DNA序列，然后保存修改。使用DNA编辑软件（如APE）设计末端引物。

创建一个新的DNA文件，以一段前导序列开始设计末端引物。随后加入载体多克隆位点（MCS）中选定的第一个限制性酶切位点，以及目的基因前18至27个碱基中的可选间隔序列。在新的DNA文件中，设计C端引物序列时，应以目的基因最后18至27个碱基开始，接着为可选间隔序列、选定的第二个限制性酶切位点，最后为前导序列。

选中整个序列，右键单击并选择反向互补，以获得反向引物。接下来，为嵌合体构建体中的每个边界区域设计引物。在嵌合体的DNA序列中，选中原始序列与插入序列连接处的30个碱基对区域。

每个序列包含15个碱基对。复制该区域，并将其粘贴到一个新的DNA文件中。该序列将作为正向引物。

复制上一步生成的正向引物，并将其重命名为反向引物。选中引物序列，右键单击，然后选择反向互补以生成反向引物序列。对嵌合DNA序列中的每个接触区重复这些步骤。

通常，除非替换发生在N端或C端区域，否则需要两对正向和反向引物来生成一个嵌合体。为构成嵌合蛋白的每个片段分别准备独立的PCR反应体系。首先将一个1.5毫升的微量离心管置于冰上，然后按照文本方案中列出的顺序加入PCR反应混合物的各种试剂。

确保每个PCR反应使用正确的引物和模板。为每个反应标记两个0.2 mL的薄壁PCR管，并在每管中加入20 µL相应的PCR混合液。将PCR管放入PCR扩增仪中，并按照文本方案中详述的程序启动反应。

PCR 反应完成后，向每个试管中加入四微升六倍 DNA 上样缓冲液。将一 percent 琼脂糖凝胶放入电泳装置中，并用 TAE 缓冲液覆盖。小心地将样品连同分子量标记物一起上样到凝胶中。

在80至120伏电压下电泳20至45分钟之后，关闭电泳仪并取出琼脂糖凝胶。在紫外光下观察扩增的DNA条带。使用刀片从凝胶中切下单独的DNA片段，并将其转移至已标记的2毫升微量离心管中。

使用PCR纯化试剂盒纯化DNA片段后，通过分光光度计测量样品在260纳米和340纳米处的吸光度，定量回收的DNA量。接下来，进行PCR扩增以生成嵌合DNA序列。首先，设置50微升PCR反应体系，将嵌合体的各个独立组分如前所述进行融合。

使用N端和C端引物，以及每种扩增的DNA片段10纳克。在30微升无核水溶液中回收并定量纯化的DNA片段，方法同前。该片段包含由末端引物中引入的限制性酶切位点所侧翼的嵌合DNA序列。

嵌合蛋白的生成以白细胞介素六家族的两个成员为例：白血病抑制因子中的抑瘤素M（Oncostatin M）和LIF。OSM-LIF嵌合体是通过将OSM的BC环区域替换为相应的LIF序列而获得的。

第一轮PCR扩增步骤包含三个独立的反应。N端OSM片段使用OSM作为模板，采用N端OSM正向引物和BC起始反向引物进行扩增。LIF的BC环片段则以LIF为模板，使用BC起始正向引物和BC N反向引物获得。

用于扩增C端OSM片段的引物为BC端正向引物和C端OSM反向引物，模板为OSM。将纯化后的片段作为模板，与N端OSM正向引物和C端OSM反向引物一起用于第二轮PCR反应，以扩增相应的OSM LIF BC环基因序列。经纯化并转化入大肠杆菌后，分离单个质粒，并通过限制性酶切鉴定筛选出正确插入DNA片段的克隆。

凝胶电泳结果显示出了阳性条带，随后将其送交测序验证。嵌合蛋白需要被表达，并在具有完全功能的体系中测定其活性。以确定被替换区域对该特定功能的重要性。

该技术非常有用且被广泛应用，通过干扰信号受体来鉴定关键的功能结构域以及受体识别位点。进行DNA电泳时应使用一次性手套、实验服和护目镜进行操作。