相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

该方法有助于解答基于蛋白质研究中的关键问题，例如新蛋白质或蛋白质结构域的注释、已知蛋白质的结构与功能特性表征、不同条件下蛋白质相互作用网络的界定或抗原-抗体特征的分析。该技术的主要优势在于完全无偏倚、通量高，并且具有模块化特性，适用于从单个基因到整个基因组的各种研究。构建domainone文库对于功能研究非常有用。

该方法可转移至噬菌体展示体系，并用于针对不同靶标（如结合蛋白或纯化抗体）的筛选。与下一代测序技术（NGS）联用，可实现极为灵敏且强大的分析。同时，专门开发的网络工具可对整个结构域组和相互作用组进行精确表征。

首先，对DNA进行超声处理，以100%输出功率进行30秒脉冲。超声处理后，将DNA标准品和超声处理后的DNA样品加入1.5%琼脂糖凝胶中。然后以每厘米5伏的电压启动电泳仪，电泳15分钟。

琼脂糖凝胶电泳显示存在 DNA 弥散条带，证实了超声处理的有效性。与此相比，未经超声处理的 DNA 则呈现清晰的单一条带。随后切下含有 DNA 弥散条带的凝胶区域，并使用基于离心柱的凝胶回收试剂盒进行纯化。

使用紫外分光光度计测定纯化后 DNA 的浓度。随后按照制造商说明书，将五微克插入片段与一微升快速平端化酶混合液进行孵育。然后在 70 摄氏度下灭活酶混合液 10 分钟。

为制备过滤载体，首先用EcoRV限制性内切酶消化5微克纯化的克隆载体。然后将已消化和未消化的载体以及分子标记物加样到1%琼脂糖凝胶上。随后在80摄氏度加热20分钟以灭活限制性内切酶。

接下来，用5单位的磷酸酶和1/10体积的10×磷酸酶缓冲液对消化后的载体进行磷酸化。然后在37摄氏度下孵育混合物15分钟。随后在65摄氏度下加热5分钟以灭活磷酸酶。

接下来，从凝胶中提取质粒并纯化DNA。然后使用紫外分光光度计测定DNA的浓度。进行连接反应时，将400纳克磷酸化的插入片段加入到1微克经消化的载体、10X T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶中，最终体积为100微升。

然后在16摄氏度下孵育连接反应过夜。次日，在65摄氏度下加热10分钟以灭活连接酶。接着，加入1/10体积的3摩尔乙酸钠（pH 5.2）和2.5体积的100%乙醇，以沉淀连接产物。

为沉淀 DNA，混合试剂并在零下 80 摄氏度冷冻 20 分钟。20 分钟后，在 4 摄氏度以最高速度离心 20 分钟。离心后，弃去上清液。

向沉淀中加入500 µL冰冷的70%乙醇，再次离心。离心结束后弃去上清液。待沉淀空气干燥后，将沉淀的DNA溶解于10 µL水中。

进行电穿孔前，将适量的微量离心管和0.1厘米电穿孔杯置于冰上预冷。然后向25微升感受态细胞中加入1微升纯化的连接产物。用移液器将DNA与细胞的混合物转移至预冷的电穿孔杯中，并轻轻弹击管壁。

然后用纸巾擦干比色皿外壁，将其放入电穿孔仪中并施加电脉冲。电穿孔结束后，立即向比色皿中的细胞加入1毫升不含任何抗生素的液体2X YT培养基。随后将细胞混合物转移至10毫升离心管中。

将离心管置于37摄氏度、220转/分钟的摇床上孵育1小时。将文库的不同稀释液接种到添加了氯霉素、氨苄青霉素以及仅含氯霉素的10厘米2X YT琼脂平板上。目的是获得单菌落，用于后续PCR检测和滴定实验。

接下来，将转化后的感受态细胞接种于添加了氯霉素和氨苄青霉素的15厘米2X YT琼脂平板上。然后在30°C条件下过夜培养。次日，选择菌落数量可计数的稀释度进行菌落计数。

然后计算文库大小。文库大小的计算方法如下：平均菌落数乘以稀释倍数，再乘以文库总体积。文库大小应达到10的6次方克隆的数量级。

如果氨苄青霉素浓度适合进行更多过滤，克隆数量将减少至未添加该抗生素时的1到20个。为检测阳性菌落，可用枪头挑取约15至20个单菌落，随后用100 µL不含抗生素的2X YT培养基稀释菌落。

接下来，以0.5微升培养物作为DNA模板，使用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。在PCR过程中，进行25个循环的扩增，退火温度为55摄氏度，72摄氏度下的延伸时间为40秒。检查插入片段的长度是否在预期的150至750碱基对范围内。

并且不同的菌落含有不同大小的插入片段。这表明文库构建在多样性方面效果良好。接下来，向150毫米培养皿中加入3毫升新鲜的2X YT培养基以收集细菌。

然后使用无菌刮刀收集细菌。充分混匀后，加入20%甘油，并分装后于-80摄氏度保存，以备后续使用。如需立即使用，可在加入甘油前，从文库的一个分装样品中提取菌液，采用柱式质粒提取试剂盒纯化质粒DNA。

使用紫外分光光度计测定DNA的浓度，然后将样品储存在-20°C，直至使用。取2.5 µL文库作为DNA模板进行PCR扩增。设置PCR仪的反应条件并开始运行。

接下来，使用索引PCR试剂盒进行索引PCR，以在多重Illumina测序运行中对双索引文库进行测序。然后设置热循环仪的反应条件并开始运行。

使用 AMPure XP 磁珠纯化后，为验证片段大小，取最终文库 1:10 稀释液中的 1 微升在生物分析仪上进行检测。然后通过选择最终文库电泳峰图中的特定区域进行定量。这些示意图表明，在将片段克隆至 P 滤膜载体后，只有含有开放阅读框（ORF）的菌落在抗生素存在下能够产生有功能的β-内酰胺酶。

过滤后，预计克隆数量将减少20倍。在较高抗生素浓度下，含有优良载体的ORF能够更好地生长。此外，ORF片段可轻松地从过滤后的文库中回收。

构建噬菌粒ORF文库，用于针对靶蛋白或抗体进行噬菌体展示筛选。随后通过下一代测序（NGS）对所有文库及获得的输出结果进行深度分析。NGS可提供关于文库多样性、丰度以及每个被筛选片段精确图谱的完整信息。

最后，所开发的相互作用组搜索网络工具能够生成原始测序读长，并将其对应至带有基因组注释的假定结构域列表。观看本视频后，您应能够充分理解如何从目标DNA来源构建并验证一个结构域组文库，以及如何通过高通量测序技术对文库进行大规模筛选。

我们已优化了ORF筛选文库在Illumina测序平台上的测序流程，并开发了一款网络工具，使得分析此类数据无需任何编程技能即可完成。