从小鼠尿路感染模型中分离用于下游单细胞分析的单个胞内细菌群落

在实验性尿路感染（UTIs）的小鼠中已观察到细胞内细菌群落（IBCs），在人类尿路感染患者的尿沉渣中也已发现此类结构。我们今天所描述的技术是一种从实验感染的小鼠中分离单个IPC的方法。

口吸微吸管技术是目前唯一可用于从感染小鼠膀胱中分离细胞内细菌的技术。制备玻璃口吸管时，牢固地夹住玻璃毛细管两端，并将管体中部沿其轴向在明火源上均匀来回旋转。当玻璃变软后，立即将毛细管移离热源，并迅速将玻璃拉断分开。

拉制后毛细管的理想最终长度应比未拉制的毛细管长三至五厘米，以确保具有合适的内径，用于分离单个膀胱上皮细胞。待玻璃冷却后，检查毛细管中部是否变窄，并确认管内仍为中空结构。用一只手握住拉制毛细管的粗端，用镊子夹住毛细管最细的部分，注意镊子施加的力度应足以牢固夹持毛细管而不致压碎。

迅速扭转镊子，使拉出的毛细管在最细处折断。然后将口径适合口控微移液管的毛细管放入100毫米的培养皿中，并用紫外光照射灭菌30分钟。为获取膀胱，将小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇对腹部区域进行消毒。

使用经乙醇灭菌的镊子和手术剪，在尿道开口上方做一个一厘米长的横向皮肤切口，并沿对角线向小鼠上肢方向扩展切口，形成一个沿小鼠整个腹侧的V形切口，以暴露腹膜腔内容物。使用新的灭菌器械，轻轻下压小鼠骨盆区域附近的脂肪垫，使膀胱突出，然后在膀胱顶端夹住暴露的膀胱。牢固握住膀胱后，剪断输尿管和尿道以游离膀胱，并将圆头镊子的一侧尖端插入刚刚切开的膀胱开口处。

松开夹住膀胱尖端的镊子，保持圆形镊子几乎完全闭合，用第二把镊子轻轻将膀胱口外端从圆形镊子上拉开，并环绕、翻过圆形镊子的另一尖端，使膀胱完全外翻。然后，用第二把镊子轻轻将外翻的膀胱从镊子尖端转移至1 mL冷PBS中。再用两把洁净的镊子轻轻刮擦外翻膀胱外表面的内层上皮细胞层。

当所有细胞均被刮下后，将已拉制的玻璃毛细管未拉细的一端插入吸管管橡胶塞中，并将1毫升移液枪头的窄端紧密插入管子的另一开口端。将2毫升吸液移液管的窄端紧密插入1毫升移液枪头开口较宽的一端，并将刮取的细胞悬液置于解剖显微镜下。使用20至40倍放大倍数，将IBC识别为较大的荧光聚集体，并将玻璃毛细管的细端浸入一管新鲜PBS中约1秒钟，以减少因毛细作用而吸入不必要的液体体积。

当定位到目标 IBC 后，缓慢将毛细管的开口端移向 IBC，并对吸液移液管施加极轻微的负压，以引导 IBC 进入玻璃毛细管。随后，将毛细管移至一个空的 1.5 毫升离心管中，施加轻微的正压，将液滴和 IBC 排出至管内。除了通过解剖显微镜确认收集管中存在单个分离的 IBC 外，还可通过共聚焦显微镜确认分离 IBC 的纯度。

分离的细胞应同时对大肠杆菌（E.coli）和尿斑蛋白（uroplakin）呈阳性染色，且大小应在50至120微米之间。分离后，可通过菌落形成单位定量或基因组当量的定量聚合酶链式反应，确认单个胞内细菌群落（IBC）中细菌细胞的存在及其活性。值得注意的是，采用相同方案分离的未感染上皮细胞中未检测到可量化的细菌。

此外，定量反转录聚合酶链式反应分析证实，在多种单独分离和混合的IBC中均存在细菌基因。务必确保口控微量移液器能够轻松吸取和排出液体。若感觉口控微量移液器堵塞，应立即更换毛细管或整个装置。

这种口腔微量移液技术使我们能够直接且特异性地研究实验性尿路感染期间形成的细胞内菌群。若无此技术，这些细胞内菌群将被细胞外细菌污染并被其数量所压倒。在本应用中所使用的埃希氏大肠杆菌（E.coli）相比，其他一些感染性病原体可能更容易气溶胶化或传播。

因此，在这些情况下，可能需要增加一些额外的对照，例如添加滤器或延长管路，具体取决于所使用的应用。采用这种口控微量移液技术分离得到的单个细胞，可进一步用于其他下游单细胞分析，例如定量逆转录 PCR（qRT-PCR）或 RNA 测序。