单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

本微流控实验装置的总体目标是实现对单个细菌细胞在恒定且高度可控环境条件下的长期观察。该方法有助于回答细菌生理学领域的一些关键问题，例如单个细胞对胁迫的长期响应模式是什么，以及群体中异质性表型随时间如何变化。该技术的主要优势在于，我们能够在恒定、均匀且高度可控的环境条件下，对单个细胞谱系进行数十代甚至数百代的观察。

根据文本方案制备PDMS聚合物后，将硅胶模具置于聚苯乙烯培养皿中一张完整的铝箔上。将脱气后的PDMS混合物倒入模具上，厚度约为五毫米。然后将培养皿至少脱气10分钟。

在60摄氏度的烘箱中固化PDMS至少一小时，随后冷却至室温。然后将带有母模和已固化PDMS的铝箔从载板上取下。小心地在铝箔上划痕，从母模背面剥离铝箔。

然后小心地将PDMS从模具上剥离。晶圆上通常包含多个尺寸略有不同的微流控装置，使用洁净且锋利的手术刀将单个装置切割至合适大小。

在装置的图案面覆盖一片半透明办公胶带，以增强图案特征的可见性。入口和出口端口位于可见流体通道两端的圆形区域。将PDMS装置图案面向下翻转，使用0.75毫米活检打孔器对准标记的点进行打孔。

然后弃去打孔的组织。可能需要使用镊子将打孔组织从装置上移除。将清洗并干燥后的盖玻片和PDMS装置放入氧气等离子体清洗仪中，并按照此处所示参数对装置进行等离子体处理。

等等离子处理一结束，立即从等离子清洗机中取出器件和盖玻片。将PDMS翻转后放置在盖玻片中央，使图案面与玻璃接触。确保进样通道与盖玻片的长边对齐。

非常轻柔地按压，以确保PDMS与玻璃表面密封。将组装好的装置置于60摄氏度的烘箱中烘烤至少一小时。烘烤完成后，通过轻轻按压装置的一角，手动检查PDMS是否已牢固粘附于玻璃上。

根据文本方案裁剪聚合物管后，如果使用夹管阀，可通过将两厘米长的柔性硅胶管剪切并连接到Y形接头的顶部倒钩上，以及将一厘米长的硅胶管连接到Y形接头的底部倒钩上来组装Y形三通接头。接着，裁剪10厘米长的聚合物管，将其一端插入Y形接头底部倒钩上的一厘米硅胶管段中，连接至切换接头。将管路另一端连接至已从塑料注射器接头移除并从针尖起约九毫米处弯折约90度的21号针头。将21号钝头针插入管段一端，用于连接注射器与切换装置的管路部分。将每段管路的另一端插入Y形三通接头进液口倒钩上的硅胶管段中。

根据文本方案，将细菌培养基（添加BSA）装入注射器后，将装有培养基的注射器连接至已准备好的21号针头，再连接到进液管路，并将注射器装入注射泵中。通过以高流速运行注射泵并使注射泵垂直放置，轻敲注射器使气泡上升至顶部，从而从进液管路中排出空气。当注射器中的空气排尽后，将注射泵置于水平位置，并从注射器开始，沿聚合物管路逐步轻敲或弹拨，经切换装置向上移动，以松动并排出任何残留的气泡。

如果更换培养基，则对第二组注射器重复此过程。排出气泡后，将第二相注射器泵设置为1.5微升/分钟，然后暂停流速。将小型文件夹夹子夹在Y型接头分支上对应第二培养基相的柔性管路段上，并继续运行第一相泵，以清除Y型接头下游的第二培养基。

加载PDMS装置时，首先将空的细口凝胶加样枪头轻轻插入微流控装置的出口孔中。使用细口凝胶加样枪头和P200移液器，向入口孔中注入含有1毫克/毫升BSA的培养基，以对装置进行钝化处理；同时观察枪头和出口孔，以监测微流控通道的填充情况。将装置在室温下孵育约5分钟。

接下来，使用类似的吸头，通过出口通道的吸头监测细胞在装置中的流动情况，将重悬的细胞分别加入每个通道。逐个小心地从出口孔中移除凝胶上样吸头，以防止损坏装置。将装置置于台式微量离心机中，使用合适的转子适配器，在约 6,000 × g 条件下离心 10 分钟。

在显微镜下确认上样成功，但不要将装置固定到载物台插件上。通过用胶带将 PDMS 两侧的盖玻片固定到载物台插件底部，小心地将已上样的装置安装到载物台插件上。将载物台插件与装置的组装体翻转，使 PDMS 面朝上，并将其放置于柔软表面（如无尘擦拭布）上。

将第一相注射泵的流速调节至 35 微升每分钟。然后依次操作每一通道，先插入进样针，再插入通向废液烧杯的出样针。目视检查装置是否泄漏后，观察出样管路中是否有过量细胞出现；过量细胞会在培养基弯月面中呈现为一条浑浊条带，并缓慢向废液烧杯方向移动。

当设备运行约15分钟后，将第一阶段注射泵设置为1.5微升/分钟，并暂停流体流动。将整个泵和装置移至倒置荧光显微镜下，然后以1.5微升/分钟的速度重新启动第一阶段培养基的流动。小心地将带有装置的载物台插入件安装到显微镜上，必要时使用胶带引导进样和出样管路。

在设备上找到合适的成像位置，并按需开始成像。请注意，细胞通常需要数小时才能恢复至稳态并进入对数生长期，因此可根据需要延迟图像采集的开始时间，以确保成像在平衡期结束后进行。若需在连续成像轮次之间更换培养基，请先暂停第一相注射泵的流液，小心取下第二相硅胶管上的文件夹夹子，并将其逐一移至Y型连接处第一相分支的硅胶管上，然后重新启动第二相注射泵的流液，继续成像。

通过相差显微镜评估，在将微流控管路连接至装置之前，若所有或几乎所有的微流控侧通道中均含有一个或多个细菌细胞，则认为初始细胞加载成功。一旦装置完成初始加载，需以相对较高的流速进行平衡。如图所示，对已平衡的装置进行显微观察时，大多数侧通道中应可见少量细胞以单列形式被限制在通道内。

当平衡后的装置在37摄氏度、流速为每分钟1.5微升的条件下置于显微镜下进行流动培养时，细胞将在大约两小时内恢复为均匀且持续的指数生长期。恢复指数生长期的细胞可被稳定地用于明场或荧光显微镜成像，持续时间至少可达24小时。引入培养基切换可扩展可开展的实验范围，但同时也可能因进样口处的气泡或细胞团块脱落并进入 feeding channel，从而增加灾难性细胞死亡事件的发生频率。

一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在五小时内完成。通过使用该方法，并结合不同的荧光报告基因、菌株及环境条件，可检测多种生理现象，包括极为罕见或短暂发生的事件。