化学分离、定量与爬行动物皮肤脂质的分离

本方案使研究人员能够分离爬行动物在化学通讯中使用的生物活性信号分子。此外，还可对这些化合物进行分离和纯化，以用于进一步测试，甚至鉴定。采用该方法，研究人员可获得化学信号物质来源，并将其提取出来，用于定量分析或独立的生物活性检测。

今天由我实验室的荣誉论文学生Holly Rucker演示该操作步骤。首先，将5平方厘米大小的样品放入带有可耐受己烷的密封盖的玻璃容器中，并向容器中加入足量己烷，确保完全浸没蜕下的皮肤组织，然后密封容器。次日，使用洁净的金属镊子取出蜕下的组织，在夹取过程中轻轻振荡样品，以使残留的己烷保留在容器内。

为确定提取的脂质质量，将提取物转移至已预先称重的圆底烧瓶中，并开启旋转蒸发仪的真空源，确保真空压力足以使烧瓶固定在冷凝管接口上。打开冷凝管末端的通气阀，将烧瓶滑入冷凝管接口，然后关闭通气阀以密封系统。检查烧瓶在释放后无法从冷凝管上脱落。

将烧瓶缓慢下放，直至烧瓶底部约10%浸入水浴中，并以中等速度开始旋转。若真空度、转速、冷凝器流速和水浴温度均处于最佳状态，则从烧瓶中逸出的溶剂蒸气将在冷凝线圈上冷凝，并滴入回收烧瓶。在真空条件下持续蒸发样品，直至烧瓶底部仅剩直径小于1厘米的液滴可见。

然后关闭旋转和真空，将烧瓶从水浴中取出。在释放真空密封时，用手握住烧瓶颈部，并旋转颈部使烧瓶从冷凝器上卸下。随着己烷蒸发，提取物中的液滴将凝固。

在室温下干燥约五分钟后，烧瓶中的脂质将形成半透明的白色至黄色蜡状物。称量烧瓶以获得最终质量，并将脂质溶于已记录体积的正己烷中，使每毫升正己烷中溶解的脂质含量达到一毫克或更多。为制备色谱柱，使用一根比色谱柱更长的木制棒，将一块4厘米×4厘米的折叠玻璃纤维置于玻璃色谱柱底部。

将层析柱固定在通风橱内的标准铁架台上，并打开活塞。接着，将洗涤并干燥后的沙子倒入层析柱中，直至玻璃纤维上方约有三厘米厚的沙层。然后，在层析柱下方放置深色纸张，并轻轻敲击柱体。

现在，在柱子下方放置一个 500 毫升的烧杯，并用约 25 毫升的己烷缓慢润湿砂层，当砂层上方的己烷液面高度约为 0.5 厘米时，关闭活塞。为活化中性 illumina，用移液管将体积等于 illumina 质量 6% 的去离子水以液滴形式均匀滴加至 illumina 中。然后盖住装有活化 illumina 的烧瓶，剧烈振荡溶液，使电荷均匀分散。

当看不到明显的Illumina凝块时，加入己烷，直至Illumina完全被约0.5厘米厚的己烷覆盖。轻轻旋转烧瓶形成浆液，并在柱子下方放置一个新的500毫升玻璃烧杯。打开活塞，再次轻轻旋转Illumina，然后将其稳定倒入位于柱子储液槽中的通气漏斗内，注意使Illumina在柱内均匀沉降，避免形成大的气泡或裂纹。

当 illumina 的液面稳定，并且位于储液管底部下方约四厘米处时，即形成柱体。然后，使用移液器用正己烷冲洗储液管内壁，以去除残留的 illumina，并在 illumina 上方轻轻加入第二层砂，使砂层顶部距离储液管口约一厘米。进行脂质提取物的分段分离时，使用长玻璃移液器将脂质样品转移至柱中，并缓慢吸取提取物，避免扰动砂层。

用5毫升正己烷冲洗提取液小瓶，并将洗涤液转移至层析柱中。当所有提取液加入后，打开活塞，使样品进入层析柱。样品加入后，层析柱必须始终保持溶剂饱和状态。

如果柱子干涸，样品将会丢失。将一个预先称重并标记好的圆底烧瓶置于柱子下方，用于收集第一段馏分。使用带通气孔的玻璃漏斗，将100%正己烷沿储液层侧壁倒入，以避免扰动砂层。

然后打开活塞开始洗脱，当柱子顶部的砂层上方剩余约三毫升正己烷时，关闭活塞。由于较大的动物因其总皮肤表面积更大而自然产生更多的皮肤脂质，因此有必要将提取的脂质质量标准化为动物的吻肛长度。一旦将提取的皮肤脂质质量标准化为总蜕皮质量，提取的皮肤脂质质量与所提取蜕皮质量之间的线性关系便完全消除。

经过分级分离后，可对各单一分馏组分的质量采用相同的标准化方法。例如，在总提取脂质质量中，各个分馏组分的贡献并不均等，因为中性脂质在质量比例上占主导地位，而各类极性更强的脂质所占比例相对较小。如果化合物鉴定是最终目标，则必须使用洁净的玻璃器皿，并避免使用塑料制品，以防止样品受到污染。

对于化合物鉴定，可在样品采集后采用液相或气相色谱与质谱联用技术进行分析。或者，可开展生物测定以阐明样品的生物活性。