使用成熟细胞器分离试剂盒快速分离脂滴的实验方案

脂滴生物学的研究一直受到纯化困难的限制。此外，研究细胞内脂质流动需要同时纯化多种细胞器，而目前尚无简单的可用方案。该技术的主要优势在于使脂滴纯化变得更加便捷可行。

我们改进了一种市售试剂盒，可从单个样品中同时分离脂滴、内质网和溶酶体。肝脏中脂滴的积聚使肥胖和酗酒患者易患进行性肝病。这一发现已将脂滴的角色从惰性储存区室转变为具有重要生物学功能的动态细胞器。

首先，使用无菌镊子和解剖剪沿安乐死小鼠腹部的后-前轴方向剪开皮肤和肌肉层，暴露肝脏。剪断肝脏与肠道相连的韧带。用镊子将肠道从肝脏处向后方牵拉，使其与肝脏分离。

切断肝脏与膈肌之间的韧带。然后，从腹侧向背侧方向，在肝脏与背侧肋骨之间进行剪切，直至完全游离肝脏。将肝脏转移至含有10毫升冰冷1×PBS的5厘米培养皿中，并在4摄氏度下，于10毫升冰冷1×PBS中于摇床上洗涤两次，每次5分钟。

最后一次洗涤后，倒掉 1× PBS，使用 10 号无菌外科刀片在培养皿内将肝脏切成三至五毫米大小的组织块。随后，用 10 毫升冰冷的 1× PBS 在 4°C 下洗涤两次，每次 5 分钟。弃去 1× PBS，将切好的肝脏组织块转移至一个预冷的 45 毫升 Dounce 匀浆器中，确保所有组织块均位于底部。

加入7毫升预冷的1×IE缓冲液。在冰上通过上下移动研杵20次进行匀浆，确保每次移动时研杵均到达匀浆器底部。将匀浆液转移至预冷的15毫升离心管中。

用一毫升冰冷的1× IE缓冲液冲洗匀浆器，并将其加入到其余匀浆液中。为去除细胞核，在4°C条件下，将匀浆液于高容量离心机中以1,000 × g离心10分钟。确保15毫升离心管顶部聚集的任何脂质均被重新悬浮，以防止脂滴丢失。

确保管底的细胞核沉淀物不受扰动，将含有脂质的上清液转移至一个新的预冷的50毫升离心管中。取100微升上清液，转移至冰上预冷的1.7毫升微量离心管中，用于后续纯度分析。为去除线粒体，将上清液样品在4摄氏度下，于预冷的高速离心机中以12,000 × g离心15分钟。

确保管顶部收集的任何脂质均重新悬浮，以防止脂滴丢失，然后将线粒体上清液转移至13毫升超速离心管中。取100微升线粒体上清液，转移至冰上预冷的1.7毫升微量离心管中，用于后续纯度分析。用预冷的1×IE缓冲液将超速离心管中的线粒体上清液加至满，以防止超速离心过程中管体塌陷。

平衡样品后，在4°C条件下，于超速离心机中以100,000 × g离心60分钟。去除LD层时，将离心管倾斜至45度角，用玻璃移液管吸取。将沉淀转移至预冷的1.7毫升微量离心管后，从脂质层下方收集100 µL的ER上清液，用于纯度分析。

为沉淀所有细胞碎片，在4°C条件下以最大转速在微量离心机中离心五分钟。随后用手轻轻温热离心管，以助于重悬脂滴层，并将上清液（包括脂质层）转移至新的1.7毫升微量离心管中。重复这些洗涤步骤，期间温热离心管两到三次，直至沉淀物不再可见。

随后，为洗涤去除了沉淀的脂滴上清液，加入1× PBS至终体积为1.5毫升，在4°C条件下以微量离心机最高速离心5分钟。使用玻璃移液器小心移除位于脂质层下方的1毫升1× PBS，注意不要扰动脂质层。重复脂滴洗涤4至5次，直至1× PBS在视觉上完全透明、无任何浑浊。

然后，使用玻璃移液管去除脂质层下方的所有1×PBS，将所得的纯脂滴组分用于后续分析。当分别采用ER试剂盒脂滴分离法和蔗糖梯度脂滴分离法获得代表性20倍荧光和明场脂滴图像时，两种方法显示的颗粒物水平相似，表明使用两种不同方案所获得的纯度相近。纯化后，采用比色法测定脂滴中的甘油三酯和蛋白质水平，并将数据归一化至肝脏重量，结果显示，在起始材料量归一化的条件下，使用ER试剂盒法与蔗糖梯度法所获得的脂滴甘油三酯和蛋白质产量相似。

使用图像分析软件对脂滴（LD）直径进行定量，结果显示内质网（ER）试剂盒法脂滴分离与蔗糖梯度法脂滴分离所获得的脂滴大小相似。为评估脂滴纯度，通过免疫印迹法对样品进行检测，结果表明，采用ER试剂盒法和蔗糖梯度法分离的脂滴纯度相当。脂滴标志蛋白PLIN2在所有样品中均有检测到，但ER试剂盒法分离的PER组分及蔗糖梯度法的PNS组分除外。

使用免疫印迹法对内质网组分进行纯度分析，结果显示该组分不含脂滴标志物PLIN2，但含有较高水平的内质网SEC61A蛋白。此外，还评估了使用溶酶体富集试剂盒进一步纯化后溶酶体组分的纯度。目前，该方案最有价值的应用在于发现性研究。

我们在分离纯化的细胞器中进行脂质组学分析，并发现脂毒性物质在酒精性肝病中的脂滴内特异性增加。