小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估

主要报告强调了在大多数模型中准确定位基底膜特定频率区域的重要性，该区域的突触数量发生变化，其功能可被分析。通过结合使用位置-频率图谱和耳蜗图数据，可可靠地实现特定频率区域的耳蜗定位。该显微镜为多项研究提供了重要见解。

这支持了耳蜗神经病变是先于听力损失、耳鸣和听觉过敏的首要初始事件的观点。在确认麻醉后的八周龄成年C57黑6J雄性小鼠对脚趾夹捏无反应后，将小鼠置于37°C加热垫上，并放置于电学和声学屏蔽室内。

接下来，将一根皮下记录电极（20 毫米长，28 号针头）置于颅顶皮肤下方 3 毫米深处。参考电极置于测量耳同侧耳廓下方的腮腺区域，接地电极置于对侧腮腺区域。将一个带有 2 厘米长塑料管（管尖呈锥形）的封闭场扬声器放置于小鼠旁边，并将管尖插入外耳道。

对于听觉脑干反应（ABR）记录，以90至10分贝的声压级、每步5到10分贝的递减方式产生短音刺激。在此步骤中，对反应信号进行放大、滤波和平均处理。在每个频率下，确定ABR阈值，即通过目测可清晰识别出一个或多个可分辨波形的可靠ABR记录所对应的最小声压级。

ABR 记录完成后，从腹侧暴露鼓室，用尖头剪刀打开鼓室以进入耳蜗。使用精细镊子去除颞骨并切断镫骨动脉。随后从卵圆窗移除镫骨，并刺破圆窗膜。

用13毫米27号针头的尖端轻轻旋转，在耳蜗顶点处制造一个小孔，然后使用细尖移液管通过该孔轻轻将4%多聚甲醛冲洗入外淋巴腔隙。接着，用冰冷的新鲜0.1摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）清洗骨组织三次，每次洗涤五分钟。随后在室温下，将骨组织置于10% EDTA中脱钙处理四小时，并以每分钟20转的速度在水平摇床上进行。

孵育结束后，在解剖显微镜下将脱钙的颞骨转移至新鲜的0.1摩尔PBS中。使用3号和5号Dumont镊子以及27号针头，依次分离耳蜗的顶回、中回和底回区域。用剃须刀片沿螺旋韧带做一系列小切口，并移除前庭膜和盖膜。

将剩余的听觉上皮组织（包括螺旋缘）进一步分离，按单个耳蜗回旋进行分离，以制备整体封片。然后使用光学显微镜的40倍油镜，结合置于目镜中的250微米刻度尺测量基底膜长度。测量时可沿内毛细胞的静纤毛方向进行调整。

解剖后，将每个耳蜗转放入单独的2.5毫升离心管中。在旋转仪上，用含0.1% Triton X-100的PBS配制的10%山羊血清在室温下孵育一小时，以阻断非特异性结合。孵育结束后，在解剖显微镜下使用200微升移液器吸头移除溶液。

将标本与用含5%正常山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS稀释的一抗在4摄氏度旋转孵育过夜。次日早晨，用冰冷的0.1摩尔PBS每次洗涤5分钟，共洗涤三次，以去除残留的一抗。随后在避光条件下，将标本与用含5%正常山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS稀释的相应二抗在室温下旋转孵育2至3小时。

孵育结束后，按照所示方法用 0.1 mol PBS 洗涤样品三次，并将标本转移至含有 0.1 mol PBS 的独立 35 毫米培养皿中。在载玻片上滴加一滴含 DAPI 的封片介质，然后将标本从 PBS 中转移至封片介质中。将盖玻片的一边接触每张载玻片，然后缓慢松开，使盖玻片轻轻盖下。

然后将载玻片置于4摄氏度的载玻片盒中过夜干燥。为成像样本，使用配备适当激光器和63倍高分辨率油浸物镜的共聚焦显微镜，从每个耳蜗转中获取8微米的共聚焦Z轴堆栈图像。对于突触斑点计数，将Z轴堆栈设置为0.3微米的步长，以覆盖整个内毛细胞的长度，确保所有突触斑点均可被成像，并将Z轴堆栈中包含斑点的图像合并，获得Z轴投影图像。

将合并后的图像导入合适的图像处理软件程序中。将每个Z轴堆栈在特定频率区域内的突触总数除以DAPI阳性内毛细胞的数量，以计算每个细胞的突触斑点数量。在每个特定频率区域，对三个不同显微视野图像中的突触斑点数量取平均值，每张图像包含9至11个内毛细胞。

为了更清晰地观察细胞骨架结构和突触定位，使用画笔工具直观评估单个内毛细胞的突触结构及其分布情况。为观察突触前带状体与突触后受体斑块的相对位置关系，可使用矩形选框工具提取带状体周围体素空间，并通过图像切割分离单个带状体。随后点击图像→图像大小，生成这些微型投影的缩略图阵列，用于区分成对的突触与孤立的带状体（orphan ribbons）。

在此代表性实验中，全部十只小鼠对不同频率短声刺激的听觉脑干反应（ABR）阈值介于 25 至 70 分贝声压级之间，具体数值取决于刺激频率。本实验的最低听阈出现在 16 千赫兹，对应于耳蜗顶点起约 43% 的位置，表明其他耳蜗区域的声学敏感性显著降低。将听觉上皮的整体铺片标本分为三段，测量各段长度并换算为距耳蜗顶点的百分比距离。

利用对数函数计算耳蜗每转中基底膜上的频率位置。在成年小鼠的正常耳中，免疫染色显示突触带状体与谷氨酸受体斑块成对并列分布。通过研究内毛细胞的基底外侧膜表面，可见每个细胞有8至20对这样的结构。

尽管在正常耳中，绝大多数的点状结构表现为成对并列，但在高倍镜下偶尔也能观察到孤立的突触带。内毛细胞突触带的数量在16千赫兹区域最高，并随着与该区域距离的增加而显著减少。进行此操作时最重要的是必须确保耳蜗基底膜的完整性。

我们必须强调准确性，直至达到技术熟练程度。通过遵循此操作步骤，可实施基因治疗，以验证该方法是否能够修复耳蜗神经病变。该方法是一种更广泛的技术，可用于探究耳蜗神经病变，特别是与听力损失、耳鸣及听觉过敏等初始症状相关的早期事件。