使用光片荧光显微镜成像衰老的耳蜗

我们开发了一种光片显微镜，能够对整个耳蜗进行数字化成像。该显微镜采用空气介质物镜，具有较长的工作距离，可对从小鼠耳蜗到大型人类颞骨的样本进行成像。它利用激光束对耳蜗进行连续切片，且不会造成任何机械性损伤。

我们的成像方法可用于评估耳蜗中的病理变化，例如因衰老导致的毛细胞和螺旋神经节神经元的丢失。在处死并断头一只小鼠后，通过脑组织做一条背腹向切口以将颅骨一分为二。移除脑组织，并在颅骨的基底腹侧部分识别出圆形的鼓室。

使用咬骨钳打开鼓室。然后观察并移除耳蜗。在解剖显微镜下以五倍放大倍率观察，用锐利的探针刺破卵圆窗并移除镫骨。

然后，将探针插入圆窗，刺破膜。进行固定时，用连接在装有2毫升福尔马林的一毫升注射器上的输液装置的剪断尖端覆盖打开的圆窗。在两分钟内缓慢将福尔马林注入耳蜗的外淋巴间隙，确保福尔马林从打开的卵圆窗流出。

修剪掉耳蜗上多余的组织。将其浸入含有10%甲醛的瓶子中，并置于旋转器上过夜。进行脱钙时，用PBS冲洗耳蜗三次，每次五分钟。

将样品浸入含有10% EDTA溶液的瓶子中。在旋转条件下孵育四天，每天更换一次溶液。随后，用PBS缓冲液灌注耳蜗三次，每次更换之间浸泡15分钟，以彻底清除所有EDTA。

洗涤后，用浓度递增的乙醇对耳蜗进行脱水处理，每种浓度处理30分钟。将整个耳蜗浸入罗丹明B溶液中，在旋转条件下过夜染色。用两次更换的100%乙醇去除耳蜗中多余的染料，每次更换后孵育5分钟。

将染色后的耳蜗转移至两份Spalteholz透明液中，每次更换溶液，每次浸泡30分钟。随后在透明液中旋转过夜。将耳蜗的卵圆窗和圆窗膜端附着于标本杆上。

确保透明溶液保留在耳蜗内，避免产生气泡。使用紫外光固化胶将湿润耳蜗的卵圆窗和圆窗两端粘附到干燥的样本杆上。用紫外灯围绕耳蜗照射10秒，使紫外胶固化。

将耳蜗悬浮于成像室内的光学透明石英荧光计样品池中，样品池内充满Spalteholz溶液，并将标本杆固定在可旋转的支架上，该支架同时连接至X/Z平移台。然后，使用自行设计的程序控制标本沿X轴方向移动，并在Z轴方向进行步进扫描，从而在整个耳蜗范围内获取一系列2D图像。图像处理时，将图像序列转移至另一台计算机，并导入3D重建软件中进行三维重建与定量分析。

小鼠耳蜗的直接体绘制显示了卵圆窗和圆窗、包含毛细胞的柯蒂氏器，以及被分割并进行体绘制的罗森塔尔管，沿其全长显示了螺旋神经节神经元（SGNs）。利用TSLIM技术，对一只三个月龄的年轻小鼠和一只23个月龄的小鼠耳蜗进行了成像并计数SGNs。以罗森塔尔管距离为函数的SGN细胞计数在线性图中显示，在耳蜗的中段和顶端区域，年轻小鼠的SGNs数量多于年老小鼠。

通过使用聚类分析和三维重建软件，可直观显示螺旋神经节神经元（SGNs）的明显丢失。螺旋神经节密度差异以颜色梯度表示，其中高密度区域为黄色，蓝色则代表低密度区域。聚类分析清晰地展示了沿罗森塔尔管全长分布的细胞密度较低区域。

光片显微镜旨在生成排列良好的图像序列，从而可对结构进行三维体积重建。三维重建程序能够对结构及其不同结构之间的解剖学关系进行定量评估。然而，由于三维重建程序提供了大量不同的用户参数，要有效使用这些程序需要经历较陡峭的学习过程。