利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

本研究通过将实体瘤移植物植入骨骼，可灵活地构建原发性骨肿瘤或骨转移模型。该技术不同于将肿瘤细胞悬液注射入骨骼的方法，能够克服肿瘤细胞悬液注射所导致的肺栓塞局限性。

另一个优势是与自发性骨转移或血管内细胞注射相比，能够创建更为均一的模型。基于实体瘤移植技术，其应用不仅限于人源或小鼠模型，还可使用患者来源的异种移植模型（patient-derived xenografts），从而为特定患者量身定制治疗方案。该模型主要用于癌症研究，包括肿瘤微环境、转移机制、药物发现、癌症遗传学以及精准医学等领域。

直观演示对于展示皮下肿瘤的建立、肿瘤移植物的分离制备以及胫骨内手术植入等关键步骤至关重要。进行皮下肿瘤诱导时，使用适当的细胞解离液收获目标细胞系，并将细胞重悬于每100至150微升无菌PBS中含有1×10⁵至2×10⁵个细胞的浓度中。将细胞置于冰上保存。

用70%乙醇清洁暴露的皮肤，并将细胞加载到配备27号针头的结核菌素注射器中。然后将细胞皮下注射至消毒且不受肩胛骨运动影响的皮肤区域。使用游标卡尺监测背部胸壁或腹部皮下肿瘤的大小，并每周测量动物体重，以确保肿瘤未发生溃疡或小鼠未达到机构动物护理和使用委员会规定的早期剔除标准。

当肿瘤在任一维度达到15毫米时，使用70%乙醇对皮肤进行消毒，并用15号手术刀切开覆盖肿瘤的皮肤。使用无菌外科剪锐性分离肿瘤与其周围相连的软组织，将肿瘤置于含完全生长培养基的六孔板的一个孔中。用手术刀将肿瘤切成适当大小的组织块，并将组织块转移至室温下装有无菌完全生长培养基的新容器中。

进行冷冻保存时，将多个组织片段汇集于一支冻存管中，加入含有20%胎牛血清和10%二甲基亚砜的完全培养基，使用商用冷冻保存系统在-80摄氏度条件下逐步降温冷冻组织，随后长期保存于液氮中。若需保存肿瘤组织片段用于后续分析而非再次移植，则通过浸入液氮进行速冻，并将冷冻的肿瘤片段长期储存在-80摄氏度条件下。进行皮下肿瘤片段移植前，首先将肿瘤片段悬液恢复至室温。

接下来，确认麻醉后的受体小鼠对足底反射无反应，并皮下给予镇痛剂。为尽量减少对皮肤的潜在损伤，使用脱毛膏去除连接后肢右侧膝关节及近端胫骨处的毛发。用70%乙醇擦拭暴露的皮肤，随后交替使用氯己定和生理盐水进行擦洗。

在屈曲和伸展关节的同时，将胫骨近端定位在膝关节远端稍下方的区域，使用15号手术刀片在肢体内侧、胫骨近端水平的皮肤和皮下组织上做一长度为3至4毫米的切口，以暴露胫骨近端的内侧皮质。为在胫骨近端内侧皮质上制造一个小孔，可将25号针头的尖端置于距膝关节约2毫米远端、且位于胫骨前后皮质之间等距的位置，边旋转边施加轻柔压力。当小孔形成后，使用无菌镊子或27至30号针头将至少0.5立方毫米的肿瘤组织碎片插入胫骨近端的骨髓腔内，并用27至30号针头将肿瘤碎片推入骨髓管中。

放置所有组织片段后，使用适当的材料对合皮肤边缘，并将动物放回笼中，持续监测直至恢复自主活动。随后通过每周进行数字X线摄影、生物发光或荧光成像无创评估胫骨肿瘤的生长情况，并使用游标卡尺测量植入部位的肢体尺寸。可通过高级影像学技术记录移植成功的情况。

在此代表性分析中，用于肿瘤移植物植入的皮质缺损在植入后一周即可在胫骨近端观察到。至第二周时，可观察到明显的骨溶解及邻近皮质缺损处的骨重塑。从第二周至第五周，随着肿瘤的植入与生长，进一步的进行性骨破坏以及新生骨形成相继发生。

在胫骨近端创建小孔时应小心操作。依靠针尖旋转并施加轻柔至最小的压力，让针尖自行完成工作。完成此操作后，可进行其他骨部位的肿瘤移植物植入、类器官或肿瘤细胞在细胞外基质中的骨缺损植入，以及分子和组织学分析，此外还可进行影像学检查。