一种快速简化的高通量分离高纯度高密度脂蛋白中miRNA的方法

本方法的总体目标是建立一种简化的方案，以快速从人血浆中分离出高纯度的高密度脂蛋白（HDL），用于微小RNA分析。该方法有助于解答肝病学和心脏病学领域的一些关键问题，例如阐明高密度脂蛋白的分子机制及其保护功能。该技术的主要优势之一是，可在较短时间内从较少的样本体积中预先分离出高纯度的HDL微小RNA。

在本方案中，通过多次离心步骤从空腹外周静脉血样本中获取血浆，具体操作如方案文本所述。将血浆转移至新离心管中，并按照制造商说明书，在室温下使用密度计测量血浆密度。

为了去除代表microRNA污染来源的循环外泌体，向1毫升血浆中加入252微升外泌体沉淀液，并在4摄氏度下孵育30分钟。然后将混合物离心30分钟，使外泌体形成沉淀。

将1毫升所得上清液转移至聚碳酸酯厚壁超速离心管中，用于后续处理，如下一个视频片段所示。高密度脂蛋白（HDL）的分离采用三步密度梯度超速离心法，该方法依次分离极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和HDL。三种不同密度的溶液A、B和C必须按照方案文本中描述的步骤新鲜配制。

在一支6.5毫升聚碳酸酯厚壁超速离心管中，加入1毫升血浆和200微升无核酸酶的Fat Red 7B，混匀。然后，小心地将5毫升溶液A叠加在混合物上方。如有需要，可在溶液A上方额外添加Fat Red 7B，以平衡各离心管之间的重量。

将离心管装入预冷的转子中。将转子放入落地式离心机，离心两小时。运行结束后，应可见两层。

移除上层1.5毫升液体，即VLDL组分，并将其储存在4°C。使用移液器从管底转移4毫升液体至新的50毫升离心管中。

此溶液含有LDL和HDL组分。下一步是分离LDL。将2毫升溶液B和100微升无核酸酶的Fat Red 7B加入含有LDL和HDL组分的试管中。

置于冰上5到10分钟。将6.5毫升混合样品转移至聚碳酸酯厚壁超速离心管中。将离心管放入预冷的转子中，离心3小时。

离心完成后，移取1.5毫升上层液体，即低密度脂蛋白（LDL）组分，置于4°C保存。从管底转移4毫升含有高密度脂蛋白（HDL）组分的液体至一个50毫升无菌管中。第三步是高密度脂蛋白（HDL）的分离。

将2毫升溶液C、100微升无核酸酶的Fat Red 7B以及15微升98%的β-巯基乙醇加入含有HDL组分的离心管中，混匀。检查混合物的密度。将离心管放入预冷的转子中，离心3小时。

随后，移除上层两毫升液体，即高密度脂蛋白（HDL）组分，并于4°C保存。必须去除脂蛋白组分中过量的盐，以避免对后续的琼脂糖凝胶电泳和PCR造成干扰。本视频中仅针对HDL组分演示脱盐与浓缩操作。

加入13毫升冷的PBS缓冲液至HDL组分中，并转移至分子量截留值为10K的离心过滤装置中。在4 °C条件下，使用水平转子以4000 × g离心30分钟。再次使用13毫升冷的PBS缓冲液对HDL组分进行脱盐，并按前述条件进行离心。

离心后，去除含有脂蛋白的溶质，并在4摄氏度下保存。为评估分离所得脂蛋白的质量与纯度，采用人脂蛋白标准品进行琼脂糖凝胶电泳，作为分子大小参照。一次代表性分离结果（未使用β-巯基乙醇）显示，HDL组分无VLDL污染，且表现出典型的α迁移率。

然而，由于受到脂蛋白的污染，HDL 组分也显示出微量的 β 迁移率。在最后一次离心步骤中，向溶液 C 中加入 β-巯基乙醇，可有效去除 HDL 组分中所有污染的脂蛋白。为了验证利用本方法纯化的携带于人 HDL 中的微小 RNA（micro RNA）进行定量分析的可行性，通过实时定量 PCR 扩增了两种不同的微小 RNA。

在这些扩增图中，水平线代表检测阈值。从六个样本分离的高密度脂蛋白（HDL）获得的代表性实时 PCR 数据显示，两种微小 RNA 均被稳定检测到。最后，熔解曲线分析清楚地显示出两种微小 RNA 各自具有明显单一的峰，符合前一步 PCR 中的特异性扩增结果。

一旦掌握，该技术连同脱盐步骤在内，若操作得当，可在九小时内完成。在进行该操作时，必须始终在 4 至 8 摄氏度的条件下进行，并在超速离心前调整每种脂蛋白组分的密度。

采用此方法后，还可进行其他实验，例如电子显微镜检测，以回答更多问题，如高密度脂蛋白（HDL）的纯度。该技术建立后，将使代谢综合征领域的研究人员能够探索与高密度脂蛋白相关的微小RNA作为生物标志物，在疑似脂肪肝疾病患者中的应用。此外，该方法也可用于更深入地理解高密度脂蛋白的功能及其改变细胞生物学行为的分子机制。