石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

本方案展示了一种针对早期斑马鱼胚胎冷冻切片进行连续免疫荧光与免疫组织化学染色的新方法，可实现特定细胞群体中蛋白共定位的精确定位分析。该方案的主要优势在于其灵活性，它将免疫荧光与免疫组织化学技术相结合，仅使用单张冷冻切片即可最大程度保留组织形态、实现表达共定位并提高抗体兼容性。

该方案可应用于其他鱼类或两栖类模型，因为这些领域的研究人员常常面临类似的抗体获取困难，并且通常会进行相似类型的实验。由于早期胚胎冷冻切片体积较小，且冷冻切片操作本身具有挑战性，因此处理这类样本可能较为困难，但充分的前期准备和反复练习有助于克服该方法中的各种难题。本方案包含多个需要特别操作和谨慎处理的步骤，若无实际技术示范，可能较难掌握。

首先，用镊子将之前固定并准备好的受精后48小时的嵌合体斑马鱼胚胎从含有15-25 OCT混合液的离心管中转移至塑料模具中，尽量减少混合液的带入。向模具中加入约一半体积的OCT介质，并轻轻混匀胚胎。准备好已标记的塑料模具，将所需的胚胎转移至空的、已标记的塑料模具中，尽量减少OCT介质的残留。

然后用OCT包埋剂轻轻填充至含有胚胎的模具顶部。在体视显微镜下观察，用针将胚胎调整至所需的方向。随后将制备好的模具置于带有金属平台的保温容器中，并在干冰上冷冻。

将冰桶轻轻放置在金属平台上以形成低温室，冷冻约30分钟。使用设定为零下20摄氏度的冷冻切片机，对包埋的胚胎进行10至12微米厚的冷冻切片，同时定期在显微镜下检查切片深度，以监测位置和组织情况。将切片置于带电荷的玻璃载片上，并在室温下空气干燥过夜。

在合适的容器中，用1× PBS将载玻片洗涤三次，每次五分钟。将载玻片平放在湿盒内的平坦表面上。使用疏水笔标记组织区域，以防止液体在载玻片上扩散。

每张切片加入200微升封闭缓冲液，在室温下于封闭缓冲液中孵育两小时。配制一抗稀释液和封闭缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀。轻轻倾斜玻片以弃去封闭缓冲液，然后放回湿盒中。

每个切片上加入200微升一抗溶液，作为对照的适当切片上加入200微升封闭缓冲液。将切片置于充满去离子水的湿盒中，于4摄氏度孵育过夜，注意密封湿盒边缘以保持湿度。用1X PBS在适当的容器中清洗切片三次，每次五分钟。

在洗涤和封闭缓冲液的同时，制备二抗稀释液，并用移液器充分混匀。将切片置于湿盒内的平坦表面上后，每张切片加入200微升二抗溶液。将切片在室温避光条件下于二抗溶液中孵育30分钟。

将切片置于合适的容器中，用1×PBS洗涤三次，每次五分钟。将切片放置于平坦表面后，向每个组织区域加入细胞核染色液，覆盖后孵育10分钟。倒去细胞核染色液后，用非硬化型荧光封片剂和盖玻片封片。

确保在成像前将切片置于4°C避光保存。将切片放入分别盛有1× PBS的容器中，于4°C平放过夜，并轻轻振荡，使盖玻片充分松动，以便在轻微振荡下自然脱落。切勿按压盖玻片或尝试手动移除盖玻片，应等待其在轻微外力作用下自行脱落。

取出盖玻片后，轻柔地将载玻片转移至盛有新鲜 1X PBS 的容器中。移除 1X PBS，随后将载玻片在含有 0.1% 非离子型表面活性剂的 1X Tris-缓冲盐溶液中室温孵育，每次 5 分钟，共孵育三次。接着将载玻片在 3% 过氧化氢溶液中室温孵育 15 分钟。

然后将玻片平放，逐滴加入封闭缓冲液覆盖表面。轻轻倾斜玻片以沥去封闭缓冲液。擦干组织周围的区域，并将玻片平放入湿盒中。

每张切片加入 200 微升一抗溶液，置于湿盒中，4 摄氏度孵育过夜。轻轻倾倒切片以去除一抗溶液，用 1× TBST 洗涤两次，每次 5 分钟。然后向每张切片滴加即用型背景减少封闭试剂，置于湿盒中室温孵育 20 分钟。

轻轻倾斜载玻片以沥尽封闭缓冲液。小心擦干组织周围的区域，将载玻片平放入湿盒中。每张组织切片滴加即用型二抗溶液，于室温湿盒中孵育30分钟。

轻轻倾斜玻片以沥去二抗溶液，并用1×TBST洗涤两次，每次五分钟。在擦干组织周围的区域后，将玻片置于平坦表面上，向每个组织区域加入200 µL HRP显色底物。从第一张玻片加入底物时开始计时，在室温下孵育三分钟。

弃去底物溶液。将玻片在适当的容器中用1×PBS短暂漂洗，再用去离子水洗涤两次，每次5分钟，并轻轻振荡。将玻片置于苏木精染色液中染色不超过30秒以进行复染，然后用去离子水洗涤三次，每次5分钟。

将载玻片置于含有 Scott's Tapwater 的容器中孵育一分钟，然后用去离子水洗涤三次，每次五分钟。在化学通风橱中，将载玻片依次通过去离子水配制的梯度乙醇和二甲苯进行脱水。从二甲苯中取出载玻片后，立即加入甲苯基封片介质，并加盖盖玻片。

在加盖盖玻片时，为确保成功，应从载玻片的一侧向另一侧缓慢降低盖玻片，以防止产生气泡，避免组织被遮挡。最后，使用光学显微镜结合数码相机在100倍放大倍数下观察并采集载玻片图像。本实验所用的特异性抗体可同时检测增殖细胞和供体细胞，从而识别并定量正在活跃增殖的供体细胞。

在完成免疫荧光和免疫组织化学染色后，生成高质量的图像对于准确识别单个细胞至关重要。使用图像分析软件进行图像叠加。在进行该操作时，最重要的是在免疫组织化学过程中对切片进行充分的染色和复染。

在完成该操作后，可对原始方案进行多种修改以实施其他方法，例如使用不同的抗体组合、组织类型或物种。此外，还可通过多种方式对图像进行分析以获取相关数据。该技术使我们能够通过共定位和多种遗传背景来研究细胞间的相互作用，并可类似地应用于其他需要详细共定位分析的技术。

免疫组织化学中的许多试剂具有危险性，应相应地进行处理。使用乙醇、二甲苯和封片剂时应在通风橱中操作。DAB 废液应作为危险废物处置，DAB 染色后的洗涤液应进行漂白处理。