用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

3D肠道类器官培养限制了宿主上皮与病原体相互作用的研究，因为细菌或毒力因子无法直接进入类器官腔。此外，从小分子、蛋白质到黏液等分泌物质均难以从3D培养体系中便捷地采集，用于后续分析。为克服这些局限，本文介绍了一种改良方案，可将3D人源肠类器官或结肠类器官转化为单层培养。

结肠类器官单层细胞分泌一层致密的顶端黏液层，可用于病原体与黏液相互作用的离体研究。该方法旨在提供一种可操作的模型，以研究感染初期肠道宿主与病原体之间的最早期相互作用。结肠类器官单层细胞将为研究黏液生物学提供一种新途径，而黏液生物学在宿主-病原体相互作用、微生物组研究以及炎症性肠病中具有重要意义。

该方法可应用于其他分泌黏液的器官，例如上消化道、呼吸系统和女性生殖系统。通过可视化演示，帮助使用者掌握在单层细胞生长期间以及免疫染色固定过程中黏液的保存操作。本实验操作将由本实验室的科研人员 Karol Dokladny 进行示范。

孵育包被的细胞培养物后，从24孔板中吸除培养基，并向每孔加入1毫升冰冻收获液。使用小型细胞刮刀松动并打碎基底膜基质沉淀物。特别注意靠近孔边缘的任何物质。

然后，在4°C条件下，将培养板置于摇床中以约200转/分钟的速度振荡30至45分钟。使用配有无菌滤芯吸头的P200单通道移液器吹打重悬细胞。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。

如果总悬浮体积超过六毫升，请使用多个小瓶。然后，向小瓶中加入等体积的含10毫摩尔HEPES、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和青霉素-链霉素的Advanced DMEM/F12培养基。此即洗涤培养基。

将小瓶倒置三到四次以混匀。在4°C条件下，以300 × g离心10分钟。细胞铺板前，将包被的插入式培养小室置于组织培养孵育箱中平衡至少30分钟。

对于每个待铺板的插入物，将1毫升扩增培养基置于37摄氏度水浴中预热，并加入两种抑制剂。然后将混合物加入孔板中。吸除含有细胞沉淀的管中的洗涤培养基，更换为足量的扩增培养基，确保每个插入物至少含有100微升，并重悬细胞。

然后，从每个小室中吸除胶原蛋白IV溶液，并用洗涤液每孔150微升洗涤两次。向每个小室下方的空间加入600微升扩增培养基。将冻存管中的细胞悬液用移液器吸取100微升加入每个小室中。

将培养板放回组织培养孵育箱中，静置至少12小时，避免振荡或剧烈倾斜培养板。孵育后，将培养板置于配备2.5倍至10倍物镜的相差光学显微镜上。

用不含抑制剂的培养基更换培养液，以终止抑制处理。每隔两到三天继续更换一次培养基，直至细胞融合。使用尖头镊子从24孔板中取出细胞培养插件。

小心地将插入物倒置在实验室用纸巾上，以去除顶端培养基，并擦去附着在插入物外表面的液体。在新的24孔板中，将插入物浸入冰醋酸与无水乙醇按1:3比例配制的溶液中，室温下固定10分钟。随后，在实验台面上将插入物倒置放在纸巾上，以去除固定液。

将插入物放入盛有1×PBS的塑料容器中，孵育10分钟以重悬细胞，随后进行标准免疫染色操作。如需保存，使用剃刀刀片沿插入膜边缘切割，用镊子将膜转移至玻璃显微镜载片上。

然后加入封片剂并加盖盖玻片。本实验中，人源肠类器官和结肠类器官以三维结构培养，随后解离并片段化，接种于人胶原蛋白IV包被的细胞培养小室中。通过明场显微镜观察和免疫荧光染色，每日监测单层细胞的形成进程。

接种于人胶原蛋白IV包被的滤膜上的结肠类器官片段，在接种后两到四天内形成多层单层样岛状结构。通过最大强度投影和共聚焦光学Z轴切片及其相应的正交投影显示，无细胞区域表现为核染色和顶端F-肌动蛋白染色均缺失。接种约一周后，通过F-肌动蛋白免疫荧光染色可检测到具有连续顶端表面的融合结肠类器官单层。

代表性最大强度投影和共聚焦光学切片的高倍放大图像及其相应的正交投影显示，汇合的结肠类器官单层细胞形成F-肌动蛋白周连接环以及不成熟的顶膜刷状缘。EdU掺入实验表明，在空肠单层细胞分化过程中，细胞增殖能力逐步下降。与分化五天后的空肠单层细胞相比，未分化的空肠单层细胞形态更宽、更短，其顶膜基于肌动蛋白的刷状缘也更不成熟。

将类结肠体进行碎片化处理至关重要。如果碎片过大，则无法附着于包被滤膜上，反而会重新形成三维类结肠体。我们提出了一种改进方法，用于在类结肠体单层细胞上研究黏液生物学。

可以开展其他宿主-病原体研究，以观察病原体与肠道顶膜表面之间的相互作用。