斑马鱼胚胎模式缩放研究的手术尺寸减小法

尽管比例缩放是发育系统中普遍且基本的特征之一，但许多器官和组织中其背后的机制仍不清楚。本视频介绍的斑马鱼体型缩小技术将有助于加深您对动态缩放过程内在机制的理解。使用斑马鱼进行研究的优势在于，可方便地开展活体成像、遗传学操作和定量分析。

我们的技术也非常简单，无需任何专用设备或强化培训即可应用。胚胎的健康状况是该技术成功的关键。应选用年轻的鱼类作为亲本，并在去除卵膜时注意尽量减少损伤。

同时调整卵黄上伤口的大小以及移除细胞的数量。由于我们所使用的胚胎非常幼小且脆弱，在转移和切割时必须极其小心地操作。与此同时，操作也需要迅速完成，以确保该步骤能在胚胎发育的合适时间窗口内完成。

视觉演示能够有效展示如何制备较小的胚胎。制作胚胎切割用的金属环时，将一段20厘米长、质地较硬且不生锈的不锈钢丝穿入玻璃毛细管中，在顶端形成一个长约1毫米的小环。在玻璃毛细管尖端、毛细管与金属环之间的连接处滴加少量透明指甲油，以固定金属环，注意避免指甲油沾到金属环部分，以免损伤胚胎。

然后让其自然干燥。使用实验室胶带将带有环状结构的玻璃毛细管固定在一根木制筷子上，使玻璃毛细管末端约有2.5厘米超出筷子部分，以便在后续操作中筷子部分不会浸入水中。在一个100毫米的玻璃培养皿中，用塑料刮刀将约0.5毫升的2%甲基纤维素溶液均匀且薄层地铺展在底部中央区域，厚度约为0.5毫米。

将约 30 毫升的三分之一林格氏液沿培养皿侧壁倒入，使其自然扩散至整个培养皿并覆盖甲基纤维素。将已去壳、处于 256 细胞至 1 个 K 细胞阶段的胚胎置于 2% 甲基纤维素上，确保胚胎侧向放置。为切割囊胚，使用金属环在动物极附近沿动植物轴垂直方向切割，切下约 30% 至 40% 的囊胚层细胞。

然后轻轻敲击两端，帮助剩余的细胞重新附着。对于卵黄，使用固定好的金属丝在植物极附近划破卵膜形成一个小伤口，卵黄将由此缓慢渗出数分钟，随后伤口会自行愈合。当卵黄停止渗出后，用移液器将胚胎从同一培养皿中的甲基纤维素中移出，进行恢复培养。

对所有胚胎重复进行囊胚期胚胎和卵黄切割操作，然后将培养皿静置30分钟，使胚胎恢复。接着，使用玻璃移液管将胚胎转移至预先准备好的含有新鲜三分之一浓度林格氏液的35毫米玻璃培养皿中，并将其置于28.5°C培养箱内，以确保胚胎完全恢复，之后再进行成像操作。在完成囊胚期胚胎和卵黄的两步切割后，与对照组胚胎相比，实验组胚胎在各个发育阶段均表现出大致正常的整体形态，仅存在大小差异。

另一方面，仅在囊胚期进行切割的胚胎表现出一种特殊的形态，尤其是在较早的发育阶段。在原肠胚延伸过程中，胚胎呈现出收缩和凹陷的外观。在随后的体节阶段，许多轴向水平的中线结构出现扁平化现象。

在发育的后期阶段，与卵黄相邻的体部结构（如中脑和后脑）仍表现出相对扁平的形态，这可能是由于相对较大的卵黄带来的张力增加所致。体节形成过程的延时成像显示，在对照组和切半胚胎中，后期形成的体节尺寸均小于早期阶段形成的体节。此外，在整个体节形成过程中，切半胚胎的体节均小于对照胚胎中的体节。

当对膜定位mCherry注射的胚胎进行两步切割技术时，在受精后20小时对其脊髓进行成像，结果显示由于体积减小，神经管高度降低。两步切割技术对于高效获得体积更小但其他方面正常的胚胎至关重要。在从囊胚上切割细胞时，务必注意不要切到卵黄部分。

对于卵黄，可在其上制造一个微小伤口，使内容物缓慢渗出，卵黄膜在适当的缓冲液中会自然愈合。由于经切割的胚胎可以快速恢复，因此在体积减小处理后，仍可对正常胚胎应用各种方法或分析。

该技术的简便性和多功能性非常强大，任何人都可以引入该技术来研究斑马鱼任何组织或器官中的比例放大问题。我们相信，借助该技术，研究人员能够探索此前尚未触及的多种系统中的比例放大问题。我们已在体节和神经管图式形成的比例调控方面取得了重要发现。