用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

本方法的总体目标是使斑马鱼幼鱼的显微注射更加简便和精确。该方法可帮助使用斑马鱼模型系统的研究人员将大量斑马鱼幼鱼以特定方向固定在阵列中。该技术便于对特定组织进行显微注射和成像操作，在需要大量幼鱼的应用中（如感染模型或异种移植肿瘤模型）具有很高的效率。

我在斑马鱼模型中的两种制备策略具有高度互补性。一种是人工合成且结构简单，另一种则是活体且结构复杂。

两者具有相同的尺寸刻度，均为透明材质，且均支持单细胞分辨率的观察。

如您在此所示，这些方法可以轻松结合，并可应用于几乎所有重大疾病的研究。根据文本方案，在培养皿中制备一层E-3薄膜后，将PDMS块置于其上，然后使用移液管将所需数量的胚胎转移至PDMS块表面。使用毛细环或类似工具，将胚胎推入微结构凹槽中，特别是用于背侧和腹侧方向的定位。

将幼虫装入凹槽时，应确保有足够的水覆盖PDMS块，以便于操作。同时，必须将幼虫推入凹槽中，以确保其在注射过程中保持固定位置。为将斑马鱼定向至微结构通道（该通道已根据文本方案预先制备），请使用移液管从图案化的PDMS块上吸除E-3培养基。

E-3 液面应降至方块边缘以下，但仍需保留在储液池和通道中，并在 PDMS 表面保留一层薄液膜。使用移液管将 10 个麻醉后的胚胎转移至储液池中，注意避免液体溢出边缘。利用毛细环将每个胚胎依次移入漏斗口，首先置于相应通道的入口处，确保胚胎进入通道时具有正确的方向。

然后，使用毛细环将每个胚胎沿通道滑动，直至其到达通道壁上的定向微结构，该微结构可使胚胎固定就位。在制备显微注射针和显微注射溶液后，用细锥形移液器吸头将五微升（5 µL）溶液装入注射针中。将注射针安装到固定在磁性支架上的显微操作器上，并将其连接至PICO泵显微注射仪。

然后，使用镊子夹住针尖的锥形末端，以45度角折断针尖。通过调节PICO泵控制器上的注射时间，将注射剂量调整为1纳升。在显微操作控制器上调整显微注射针的角度，初始角度设为45度，使注射针与胚胎的长轴平行。

可采用更陡的角度以尽量减少显微注射过程中胚胎的侧向移动。用左手控制培养皿，右手操作显微操作器，将注射针尽可能靠近预定的显微注射部位（例如耳泡）。使用显微操作控制器将注射针插入目标组织，然后踩下PICO泵的脚踏开关，注入预设体积的液体。

如果组织抵抗穿刺，可轻轻敲击显微操作控制器旋钮。为释放胚胎，可用转移移液管将E-3培养液从上至下冲洗组织表面，或轻轻旋转培养皿，使胚胎释放到周围的E-3培养液中。随后将胚胎转移至不含MS-222的E-3恢复培养皿中。

为了使用六孔板中各孔内的PDMS装置筛选胚胎，可采用1,000微升移液器或尖端较细的转移移液器，通过端口注入E-3培养基以预润装置。使用E-3培养基和MS-222填充孔板，直至装置完全浸没。随后，用转移移液器将四个先前已注射的胚胎分别加入每个孔中。

使用毛细环或类似工具，将胚胎置于成像通道入口处，并调整至所需方向，然后部分推入装置内。这有助于使胚胎均匀地进入装置。使用1,000微升移液器或转移移液器，从端口处吸取E-3培养基通过装置，直至胚胎被吸入通道内并处于正确的成像方向。

将培养板转移至倒置荧光显微镜。为成像胚胎，通过选择合适的物镜（例如，成像斑马鱼神经嵴细胞迁移时选用10倍物镜）来调节放大倍数。针对每个通道，调节光源强度和曝光时间，使各信号清晰但不饱和。

最后，采集每个荧光和透射光通道的图像。利用微结构化通道装置将胚胎稳定在侧向位置，检测了受精后两天斑马鱼胚胎的中性粒细胞对标准趋化因子fMLP和LTB4的响应能力，这些趋化因子被微量注射至耳囊中。为了可视化中性粒细胞的募集过程，注射时使用了高分子量的罗丹明葡聚糖进行示踪，并在携带绿色荧光中性粒细胞的转基因胚胎中进行操作。

未注射的胚胎和仅注射罗丹明的胚胎用作阴性对照。显微注射后，将胚胎转移至成像通道装置中，并在注射后30分钟和5小时，使用EVOS荧光显微镜进行成像。正如预期，在早期时间点，有少量荧光中性粒细胞被招募至模拟注射的耳囊，这可能是由于损伤介导的招募所致。

有趣的是，在实验过程中观察到罗丹明葡聚糖示踪剂在耳石中积累。对于这两种趋化因子，中性粒细胞的募集数量均有所增加，尤其是对白三烯B4（LTB4）的反应更为显著。一旦掌握，该技术可显著提高斑马鱼显微注射的速度和准确性。

该技术的开发源于我们实验室面临的特定挑战。我们优化了这一方法，以满足斑马鱼模型中真菌感染和肿瘤异种移植项目的需求。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用微结构化表面阵列进行斑马鱼的显微注射以及长期活体成像。