用于鱼类致病菌 Yersinia ruckeri 的多位点可变数目串联重复序列分析的多重 PCR 与毛细管电泳方法

该MLB基因分型方案极大地增进了我们对耶尔森氏鮰鱼菌（Yersinia ruckeri）流行病学及全球种群结构的理解，耶尔森氏鮰鱼菌是一种具有国际重要性的鱼类致病菌。与先前建立的耶尔森氏鮰鱼菌分型方法相比，该方案提供了极高的菌株分辨能力。该操作流程简单、成本低廉，且所得结果具有良好的可移植性，可方便地在不同实验室之间进行比较。

该技术显著提高了诊断特异性，并实现了感染溯源。例如，我们现在通常能够区分出在非致病性环境菌株背景下存在的高致病性鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）克隆。本次实验操作将由我们实验室的技术员 Saima Nasrin Mohammad 演示。

首先，使用无菌接种环将杀鲑气单胞菌（Yersinia ruckeri）纯培养物接种于培养皿中适当类型的琼脂平板上。在22摄氏度下培养一至两天，或在15摄氏度下培养三至四天。随后，用接种环从每个培养皿中挑取一个具有代表性的单菌落，转移至含有50微升超纯水的1.5毫升离心管中，以重悬菌体。

涡旋混匀片刻，然后在100摄氏度的加热块中孵育7分钟。接着在16,000 g离心3分钟，用移液器小心地将上清液中的模板DNA转移至空的1.5毫升离心管中。立即进行下一步操作，或将DNA在20摄氏度保存。

配制预混液时，首先根据待分析的细菌样本数量计算试剂体积，同时需包括一个阴性对照和一个阳性对照，并额外增加10%的富余体积，具体细节见文稿。注意使用不同的引物浓度。在两个独立的离心管中（每个PCR检测各用一个），分别加入多重PCR Plus预混液、引物和无RNase水。

将配制好的主混合液在低速下轻轻涡旋振荡，然后将每种主混合液分别取 22 微升加入 PCR 条带或板的各个孔中。接着，向含有主混合液的每孔中加入 3 微升已制备的 DNA 模板；每个细菌样本设两个孔，每种检测各一个。使用经验证的鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）菌株的 DNA 作为阳性对照，超纯水作为阴性对照。

密封后短暂离心。将准备好的反应体系加入PCR仪中，并根据文稿设置程序。程序将在三小时内完成。

根据制造商的建议，将琼脂糖凝胶粉末加入1倍体积的TBE缓冲液中，使其达到1.5%（重量/体积）的浓度，并加热溶解。在灌胶前，将溶解的凝胶溶液在流动水下短暂冷却，每50 µL凝胶溶液中加入5 µL荧光核酸染料，并混匀。组装并调平制胶托盘。

根据样本数量适当添加梳子。将凝胶溶液倒入模具中，静置使其凝固。随后，将含有凝胶的模具浸入凝胶电泳系统中的一倍浓度TBE缓冲液中。

在新的PCR条管中，将5 µL PCR产物与2 µL上样染料混合。将5 µL混合物转移至凝胶的加样孔中。至少保留一个加样孔为空。

在空的加样孔中加入 5 µL DNA 标准品作为参考。接通电极，以每 15 厘米 110 伏的电压电泳约 1 小时。使用基于紫外光的凝胶成像系统检测是否存在代表 PCR 扩增产物的多条条带。

在确认PCR扩增产物后，使用新的PCR条管或板，将PCR产物用纯水按1:10比例稀释。充分涡旋振荡并短暂离心。在通风橱内操作，于离心管中配制含有甲酰胺和参考大小标准溶液的预混液。

根据待分析的PCR产物数量，使用文中所述的试剂体积，并额外增加10%的余量。短暂涡旋混匀，然后将9.5微升分别加入适用于现有毛细管电泳系统的PCR板的各个孔中。

然后，加入 0.5 µL 稀释后的 PCR 产物。密封并短暂离心。随后，将含有样品的反应板放入 PCR 扩增仪中，在 95 °C 下变性 3 分钟，然后无限期冷却至 4 °C。

在1000 ×g条件下离心1分钟，小心移除密封膜，然后根据制造商说明将样品板装载到校准的毛细管电泳系统中。运行片段分析毛细管电泳，根据所选仪器选择适当的试剂，并按照论文中的描述调整运行条件。对于杀鲑气单胞菌（Yersinia ruckeri）VNTR毛细管电泳片段大小的判定，首先将毛细管电泳结果文件导入Gene Mapper 5软件中。

将分析方法设置为 Microsatellite Default，在大小标准下选择合适的产品选项，然后点击“分析”按钮。通过大小匹配编辑器，核对大小标准片段的正确识别情况，并修正任何明显错误的分配。随后，选择待读取的样本，点击“显示图谱”按钮，按下 Control A 以查看分型大小表格。

在上方图谱中，按住 Control 键的同时，点击代表 VNTR 扩增片段的五个峰。按 Control G 键以筛选分型表，仅显示这五个高亮峰的特征，并记录每个 VNTR 位点的大小分型结果，用于后续分析。为校正毛细管电泳过程中扩增片段迁移率的偏移，需结合所获得的大小分型数据与各特定位点的特异性参数，准确计算 VNTR 重复次数。

该公式可在电子表格模板中实现自动化。在电子表格中，将计算得到的VNRT重复次数四舍五入至最接近的整数，再进行后续分析。在BioNumerics软件中创建一个新数据库，并选择激活MLVA插件。

在实验类型面板中，点击“创建新实验类型”，选择“字符类型”，并在提示时使用默认设置。然后选择新建的实验，为每个VNTR位点添加新的字符，数值范围设为0到100。返回主面板后，通过选择导入字段和字符，导入杀鲑气单胞菌（Yersinia ruckeri）VNTR重复次数及方法数据。

找到存储该文件的位置，并在“目标类型”列中进行选择。对于VNTRs，这意味着选择相应的字符值，而其他元数据则归类为条目信息字段。所作的选择可保存为模板，以便后续操作更加便捷。

选择用于MST聚类分析的导入样本，然后点击“比较”面板中的“创建新比较”按钮。如需对MST的可视化呈现进行优化，可将样本分配至不同颜色的组别，例如根据特定的元数据特征进行分组。随后，选择“高级聚类分析”和“分类数据的MST”，以基于所选样本生成MST图。

通过添加分区参数、交叉长度、节点分支标签等进一步调整MST的视觉呈现效果。如有需要，可使用“导出图像”选项以所需格式导出最终的MST。多重PCR完成后，凝胶电泳图像显示所有12个含样品的泳道中均存在多个扩增产物，其中第一泳道为所用的DNA Ladder。

在毛细管电泳产生的电泳图谱中，可根据大小和染料标记的组合来区分不同的VNTR位点。橙色峰代表所使用的大?标准。图中显示了一个基于从挪威五个不同养殖场的大西洋鲑鱼中分离的杀鲑耶尔森氏菌（Yersinia ruckeri）的MLVA谱型构建的最小生成树示例。

可以观察到与农场来源相关的明显聚类趋势。利用MLVA鉴定出在特定地理区域的鱼类物种中占主导地位的不同嗜水气单胞菌克隆，这一方法已被用于改进针对该病原体的疫苗接种策略。