联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析
2019年3月30日
miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA 治疗在抑制细胞周期和血管生成中活性的分析方法。
该方法将有助于理解并掌握在体外鉴定两种微小RNA在肺癌细胞中活性所必需的实验技术。肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因。本文介绍的技术涵盖了从基础实验方法到更为复杂的实验方案，如基因表达分析和抗体蛋白微小RNA检测，这些技术专门用于鉴定微小RNA作用效果。
以下方法将帮助我们解答关于两种微小RNA（microRNA 143和microRNA 506）对肺癌细胞周期调控作用的关键问题。我们将展示多种实验技术，包括细胞转染、RNA提取、实时定量PCR以及微小RNA分析。我们希望本演示能够有助于成功完成这些分析。
首先，将培养的细胞接种于适合进行RNA和蛋白质提取的适当培养瓶中，以用于后续通过qPCR或微阵列分析进行基因表达检测。然后，在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的培养基中过夜培养。次日，通过将microRNA 143和microRNA 506分别用培养基稀释至各100 nmol/L的浓度，制备用于转染的microRNA样品。
从培养箱中取出培养瓶，弃去培养基，用1×PBS洗涤。所有未处理的对照组仅包含不含血清的培养基和细胞。
将细胞置于转染培养基中，在培养箱中孵育6小时。6小时后，移除培养基，并更换为4毫升新鲜的完全培养基。分别在24小时和48小时后通过胰蛋白酶消化法收集细胞。
接下来，每管用 1× PBS 洗涤两次，并移除上清液。如需在后续时间进行 RNA 提取，请将细胞在 -80 摄氏度下冷冻保存。RNA 提取采用 RNA 试剂盒，按照制造商提供的说明书操作。
首先，从负80摄氏度取出试管，使其解冻。加入300微升裂解缓冲液，上下吹打以破坏细胞膜。加入等体积的100%超纯乙醇。
然后充分混匀并置于不同的柱中。离心后弃去穿流液。加入400 µL洗涤缓冲液，离心以去除缓冲液。
每个样本中加入5 µL DNA酶1和75 µL VNA消化缓冲液，孵育15分钟。然后用400 µL RNA提取缓冲液洗涤样本，随后用RNA洗涤缓冲液洗涤两次。
现在，向柱中加入无核酸酶的水，离心后收集RNA。测定RNA浓度。在此阶段，可将2微克RNA样本用于RNA测序。
根据文中的方案，使用热循环仪制备cDNA。用无DNA酶和RNA酶的水配制正向和反向引物溶液，浓度为10微摩尔。根据待检测样本数量，为每个基因配制相应的主混合液。
每种 cDNA 样本的反应量均根据文中所述表格确定。将各样本分别加入对应的孔中。进行 qPCR 时，建议预先准备一份包含 96 孔板布局的 Excel 文档，以便追踪样本位置。
针对每个样本和待分析的基因，需进行三个复孔检测，至少也应设置两个复孔。使用透明、光学清晰的塑料封膜密封反应板。避免用手接触封膜的薄层塑料表面，以免产生非特异性信号。
快速离心反应板，使所有试剂混匀并沉降至各孔底部。随后，使用定量实时PCR仪运行样本板。获取qPCR仪生成的CT值，并进行相对基因表达分析。
按照本视频前面部分所述方法转染细胞。将每个样品的细胞分别收集到15毫升无菌离心管中，用于胰蛋白酶消化。随后，用1×PBS洗涤细胞两次，每次在751×g离心5分钟，然后弃去上清液。
用移液枪加入200微升预冷的1×PBS，重悬并吹散细胞沉淀。在轻轻涡旋振荡的同时，逐滴向离心管中加入2毫升70%预冷乙醇，以固定细胞。室温孵育30分钟，然后置于4摄氏度环境中1小时。
从4摄氏度取出试管并离心。加入2 ml 冰冷的PBS，涡旋混匀，然后通过离心去除上清液。在每个样品中加入500微升含碘化丙啶和核糖核酸酶A的1×PBS，其中碘化丙啶和核糖核酸酶A的浓度分别为50和200微克/毫升，于室温孵育30分钟。
将样品转移至适当的试管中，避光保存，并进行流式细胞仪检测。本实验旨在鉴定经microRNA处理后所有细胞周期通路相关蛋白表达的变化。按照转染部分所述步骤收集蛋白样品，并使用BCA法进行定量。
实验前一小时将载玻片从负四摄氏度取出，使其恢复至室温并去除水分。取 70 微克蛋白质样品，按照制造商说明书制备样品载玻片，文本部分也对此进行了逐步说明。需注意的是，使用超纯去离子水彻底清洗载玻片是另一个重要步骤，这有助于降低载玻片的背景信号。
此外，在本实验中，直到最后一步之前都绝不能让样本载玻片干燥。最后，使用微阵列仪器扫描载玻片并分析数据。对经微小RNA处理的样本进行qPCR分析，以测定CDK1、CDK4和CDK6的基因表达水平。
这些基因调控正常细胞和癌细胞的细胞周期，并已被作为抑制肿瘤进展的靶点。实验数据表明，经 microRNA 143 和 506 处理后，这些基因表现出下调效应。流式细胞术的细胞周期分布数据显示，经 microRNA 143 和 506 联合处理后，G0 和 G1 期细胞比例增加，S 期细胞比例减少。
细胞周期特异性微阵列分析检测到约60个基因的蛋白质表达变化。所示热图显示，多个对细胞周期进程和增殖至关重要的基因在蛋白质水平上发生下调，例如CDK2、Helen 1和3、RE2F1。相反，通常因其生长抑制作用而被认知的蛋白质则表达上调。
尽管结果是半定量的，还需要进一步分析，但微阵列分析能够快速概览通路的活性。我们相信，在观看本视频后，您将能够开展基础乃至复杂的实验室实验，从而帮助您鉴定细胞中微小RNA的活性。
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概述
本文介绍了分析微小RNA对肺癌细胞行为影响的方法。重点研究两种特定的微小RNA，miR-143和miR-506，及其在调控细胞周期和血管生成中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 癌症研究
背景
- 肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。
- 微小RNA在调控基因表达和细胞过程方面发挥关键作用。
- 了解其功能可为开发新的治疗策略提供依据。
- 本研究聚焦于特定微小RNA的组合效应。
研究目的
- 确定miR-143和miR-506在肺癌细胞中的活性。
- 探讨其对细胞周期和血管生成的影响。
- 提供一种全面的分析微小RNA效应的方法学。
使用的方法
- 将 microRNA 导入肺癌细胞的细胞转染技术。
- 用于后续分析的 RNA 提取。
- 定量实时 PCR 检测基因表达水平。
- microRNA 分析以评估处理措施的功能影响。
主要结果
- 证明了miR-143和miR-506能够阻滞细胞周期。
- 在肺癌细胞的血管生成中显示出显著影响。
- 揭示了这些微小RNA联合治疗的潜在应用价值。
- 验证了适用于未来研究的方法学。
结论
- miRNA 治疗剂在癌症治疗中具有广阔前景。
- 深入理解其作用机制有助于优化治疗策略。
- 未来的研究应探索更多微小RNA及其组合应用。
常见问题
行业重要性概述
通过组合性调控miRNA对细胞周期和血管生成的影响，可在与疾病相关的体系中精确研究增殖和血管通路，从而解决肿瘤学研究中的一个关键瓶颈问题。该方法通过提供定量的多参数读数，提高靶点验证的可预测性，并降低早期研发项目决策的风险。整合这些方法可增强癌症研究中从发现到临床前评估的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用miRNA扰动实现对细胞周期和血管生成靶点的功能验证。
- 通过量化治疗后基因和蛋白质表达变化，支持作用机制的去风险化分析。
- 在癌症模型中通过多重基因与蛋白质分析促进信号通路的阐明。
- 为推进基于miRNA的治疗假说提供预测性信心的数据支持。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的基于细胞的系统，用于定量评估miRNA对增殖和凋亡的影响。
- 标准化qPCR和蛋白质微阵列工作流程，以实现可重复的基因和蛋白质表达谱分析。
- 支持miRNA组合的大规模筛选，用于下游先导化合物的鉴定。
- 提供可靠且定量的输出结果，适用于化合物间的比较评价。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与肺癌进展中相关的疾病通路相联系。
- 通过关联分子变化与功能结果，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 为在转化模型中评估抗血管生成和抗增殖机制提供平台。
- 基于多参数生物学读数，为风险调整的推进决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法学贯穿肿瘤学发现的全过程，从早期靶点验证到先导化合物鉴定以及临床前机制研究。
- 发现生物学： 定量基因和蛋白质表达分析可实现假设检验和通路风险评估。
- 筛选： 标准化的基于细胞的检测方法和qPCR结果支持实验的可重复性和检测就绪性。
- 分析： 来自qPCR和蛋白质微阵列的多重读数有助于对不同处理条件进行稳健比较。
- 转化研究： 对细胞周期阻滞和血管生成抑制的功能评估与疾病相关终点保持一致。
- 企业级复用： 该工作流程可适用于在多种肿瘤模型中评估其他miRNA候选分子或联合治疗方案。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低早期肿瘤学研究中的机制模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的miRNA功能分析工作流程。
- 战略价值：基于定量生物学数据，支持科学的决策制定（推进或终止项目），实现资本高效的投资组合筛选。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的miRNA靶向治疗项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、转染和分子生物学技术方面的专业知识。
- 需要能够使用qPCR、流式细胞术和蛋白质微阵列仪器进行定量分析。
- 要求各研究团队之间对检测方案和数据分析流程进行严格的标准化。
- 可适用于多种癌症细胞模型，但可能需要针对不同细胞类型或miRNA序列进行优化。
- 对半定量蛋白质微阵列数据的解读可能需要进一步验证，以用于转化研究。
