建立并鉴定三种通过逐步增加阿法替尼剂量诱导的耐阿法替尼肺腺癌PC-9细胞系

对新型获得性耐药机制的研究将有助于为患有抗癌药物耐药且可切除癌症的患者开发更有效、更安全的治疗策略。然而，药物耐药性未能成功建立的案例通常未被报道。这种逐步剂量递增方法被认为是获得耐药细胞最可靠的实验技术。

为了确定合适的阿法替尼耐药浓度，将PC-9细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，于10厘米细胞培养皿中用生长培养基进行培养。将PC-9细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升4×10⁴个细胞，并以每孔50微升细胞悬液接种至96孔微孔板中。在细胞培养箱中过夜孵育后，向每孔加入50微升阿法替尼溶液，每个指定浓度设六个复孔。在细胞培养箱中继续孵育96小时后，向每孔加入15微升MTT染料。

在细胞培养箱中孵育4小时后，向每孔加入100微升溶解/终止溶液，并将培养板放回培养箱过夜。次日早晨，使用酶标仪在570纳米波长下测定光密度。对于持续阿法替尼暴露实验，将PC-9细胞培养于含有10毫升生长培养基的P-100培养皿中，直至细胞达到亚汇合状态。

将亚融合状态的细胞培养物转移至新的P-100培养皿中，每份初始培养皿加入九毫升生长培养基，并将细胞放回细胞培养箱中。次日早晨，向每组三个培养皿中加入0.1纳摩尔（即半数最大抑制浓度的1/10）的阿法替尼。当阿法替尼处理的细胞再次达到亚融合状态时，使用1毫升移液器充分混匀培养物，并从每个培养皿中取1毫升细胞悬液转移至含有九毫升新鲜生长培养基的新P-100培养皿中。

在新培养物中加入比原浓度高10%至20%的阿法替尼，并在培养物每达到亚融合状态时逐步增加阿法替尼浓度，持续10至12个月。当阿法替尼浓度达到1微摩尔时，进行MTT实验以确认细胞已产生阿法替尼耐药性。为确定细胞系的生长曲线，将亲代PC-9细胞及三种阿法替尼耐药细胞系在细胞培养孵育箱中接种于生长培养基中培养24小时。

将每种培养物的细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升5×10³个细胞，并在96孔微孔板中每孔接种12个100微升的重复样本，每个细胞群体每孔接种12个重复。随后按照所示方法，在培养的第0、1、2、3、5和7天进行MTT实验，并使用适当的统计分析软件绘制结果。为通过逆转录聚合酶链反应分析鉴定表皮生长因子受体（EGFR）基因组DNA表达的变化，应按照制造商说明书，使用DNA纯化试剂盒从目标细胞培养物中提取基因组DNA。

使用分光光度计测定所提取基因组DNA的浓度，其浓度为25纳克/微升。随后，使用SYBR Green主混合液扩增50纳克基因组DNA，并利用基于荧光的逆转录酶聚合酶链式反应检测系统分析结果。为通过测序鉴定EGFR基因组DNA表达的变化，使用针对EGFR外显子19至21的特异性引物扩增基因组DNA。

然后使用PCR纯化试剂盒按照制造商说明书纯化扩增的PCR产物，并对扩增子进行测序。为了通过蛋白质印迹分析鉴定表皮生长因子受体蛋白表达的改变，用阿法替尼处理细胞24小时。24小时后，每次洗涤用5毫升预冷的PBS，每种细胞培养物各洗涤两次。

在RIPA裂解缓冲液中裂解细胞，缓冲液中添加1%蛋白酶抑制剂混合物以及磷酸酶抑制剂混合物二和三，在4°C下孵育30分钟。孵育结束后，通过离心收集裂解液。采用二辛可宁酸法测定裂解液样品的蛋白浓度。

用4×上样缓冲液将蛋白样品调整至0.5 µg/µL或1 µg/µL的浓度，在96 °C下煮沸5分钟。进行蛋白质印迹分析时，组装经乙醇清洗的玻璃板和垫片，并在模具中灌注含有适当实验添加剂的8%聚丙烯酰胺分离胶。在分离胶聚合的同时，向合适的模具中加入浓缩胶溶液，插入梳子，并在室温下静置20至30分钟，使浓缩胶充分聚合。

当两块凝胶均聚合完全后，将其放入电泳装置中，并用电泳缓冲液充满电泳槽。随后，将每种蛋白质样品各 20 至 30 微升加入到每个加样孔中，在 180 伏电压下进行电泳。当染料前沿迁移出凝胶后，约 60 分钟时停止电泳，并用含吐温的 Tris 缓冲盐水洗涤凝胶 1 至 2 分钟。

通过半干转法在300毫安恒定电流下将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，持续1.5小时。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温下封闭膜1小时。随后，在4摄氏度下用目标一抗孵育膜过夜。

第二天早晨，用新鲜的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水对膜进行三次洗涤，每次10分钟，然后在室温下用相应的二抗孵育1至1.5小时。随后用新鲜的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水洗涤膜五次，每次洗涤后将膜与增强型化学发光液孵育，以通过胶片实现信号可视化。此处展示了亲代PC-9细胞的增殖随阿法替尼浓度增加而下降的现象，证实PC-9细胞对阿法替尼处理敏感。

然而，三种阿法替尼耐药细胞系在阿法替尼暴露下均未表现出细胞增殖的抑制。阿法替尼耐药细胞系的生长曲线显著慢于亲代PC-9细胞。与亲代PC-9细胞相比，阿法替尼耐药细胞表达显著更高水平的EGFR基因组DNA和EGFR蛋白。

EGFR测序结果表明，PC-9细胞在EGFR第19号外显子上存在15个碱基对的缺失，而在第20号外显子上为野生型EGFR。然而，阿法替尼耐药细胞系一和二的细胞表现出野生型EGFR第19号外显子的扩增。阿法替尼耐药细胞系三的细胞在EGFR第19号外显子上具有与PC-9细胞相同的15个碱基对缺失，但在EGFR第20号外显子上检测到T790M位点突变。

当抑制剂浓度接近IC-50值时，细胞生长可能会变得非常缓慢。不要认为细胞培养已停止，因为细胞仍会逐渐增殖。这些策略的建立旨在模拟癌症患者在临床上产生耐药性的条件，以评估获得性耐药机制，并开发安全有效的治疗策略。