开发一种人源前临床破骨细胞生成模型：外周血单核细胞与乳腺癌细胞系共培养
2017年9月13日
本方案描述了一种方法的开发过程 体外 利用乳腺癌细胞系与外周血单核细胞共培养，建立模拟癌细胞与破骨细胞相互作用的人类临床前破骨细胞生成模型。该模型可用于深入理解骨转移形成的机制，并改善治疗策略。
本研究建立的体外人源性骨细胞生成前临床模型，旨在通过将外周血单核细胞（PBMCs）与乳腺癌细胞系共培养，模拟癌细胞与破骨细胞之间的相互作用。该方法有助于解答骨转移领域中的关键问题，特别是关于癌细胞与骨细胞在骨微环境中相互作用的影响。该技术的主要优势在于其为完全人源性的前临床模型。
此外，该方法可为骨转移提供深入见解，也可应用于其他骨相关病理机制的研究，例如骨质疏松症。由于健康供体之间的个体差异以及在选择适当的外周血单个核细胞（PBMC）密度时存在难度，初学者在使用该方法时可能会遇到困难。
该方法的可视化演示至关重要，因为外周血单个核细胞（PBMC）的选取和接种步骤需要一定的手动操作经验才能熟练掌握。首先，将至少 20 毫升健康供体的 EDTA 抗凝全血与 PBS 以 1:1 的比例稀释。充分混匀后，将血液溶液分装至 50 毫升锥形管中，每管 30 毫升。
小心地将15毫升淋巴细胞分离液注入每个试管底部。通过密度梯度离心法分离细胞。将含有单个核白细胞的白色絮状层转移至新的15毫升试管中。
将收获的细胞用 20 毫升 PBS 洗涤两次，每次洗涤后，在冰上用 5 毫升红细胞裂解缓冲液裂解红细胞 3 至 5 分钟。加入 20 毫升 PBS 终止反应，并通过离心收集白细胞。重悬沉淀，加入完全 α-MEM 培养基进行细胞计数。
随后，将细胞以每平方厘米7.5 × 10⁵个PBMC的浓度接种于24孔板的每个孔中，在37°C及5% CO₂条件下进行培养。约3小时后，从培养物中移除上清液、碎片、未贴壁的细胞以及未裂解的红细胞，然后加入含有MCSF的新鲜培养基。
接种后14天，用PBS洗涤细胞两次，然后在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。按照制造商说明书进行TRAP染色。成骨细胞样细胞将呈TRAP阳性，且至少含有四个细胞核。
在显微镜下以10倍放大倍数手动计数破骨细胞样细胞。当癌细胞诱导破骨细胞分化且癌细胞达到90%融合度时，通过胰酶消化将其解离，并以每平方厘米4 × 10³个细胞的浓度接种至孔径为0.4 µm的插入式培养小室中，培养基为新鲜的α-MEM。次日，将接种了细胞的插入小室置于完全α-MEM中已贴壁培养一天的未分化单核细胞培养物上方，每2至3天更换一次培养基。
然后，在共培养开始后的第11天，将插入物转移至含有适当试剂的新培养板中，用于后续所需的分析。乳腺癌细胞能够维持破骨细胞的生成，因为癌细胞诱导的孔中破骨细胞数量与阳性生长因子对照孔中的数量相似。然而，当细胞经抗肿瘤药物处理后，所有培养体系中观察到的破骨细胞数量均减少。
有趣的是，由生长因子诱导分化的成熟破骨细胞的表面积大于由癌细胞诱导的成熟破骨游戏副本。在经抗肿瘤药物处理的培养物中未观察到此效应。若操作得当，掌握该技术后可在七至八小时内完成。
通过该实验步骤，可进一步开展基因表达分析、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光分析或酶联免疫吸附测定（ELISA）等下游分析，以深入探究癌细胞与骨细胞之间的相互作用或抗肿瘤药物的作用机制。该技术建立后，为骨转移领域的研究人员提供了在完全人源的临床前模型中研究骨微环境的新途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将单核细胞与癌细胞进行共培养并诱导其分化。
请勿忘记，处理生物样本和药物可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取佩戴手套和实验服等防护措施。
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概述
本方案描述了一种从与乳腺癌细胞系共培养的外周血单核细胞中建立体外人源破骨细胞生成的临床前模型，以模拟癌细胞与破骨细胞之间的相互作用。该模型有助于解答有关骨转移的关键问题，并改善治疗策略。
关键研究组成部分
科学领域
- 破骨细胞生成
- 骨转移
- 癌细胞相互作用
背景
- 该模型利用外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 旨在模拟癌细胞与破骨细胞之间的相互作用。
- 此项研究对于理解骨相关病理具有重要意义。
- 健康供体之间的个体差异可能影响实验结果。
研究目的
- 模拟癌细胞与破骨细胞的相互作用。
- 研究这些相互作用在骨微环境中的影响。
- 为骨转移及相关疾病提供科学见解。
使用的方法
- 外周血单个核细胞（PBMC）与乳腺癌细胞系的共培养。
- 破骨细胞生成的评估。
- 癌细胞与骨细胞相互作用的评价。
- PBMC细胞密度变异性的分析。
主要结果
- 该模型成功模拟了癌细胞与破骨细胞之间的相互作用。
- 所获得的见解可为骨转移的治疗策略提供参考。
- 潜在应用可扩展至其他骨相关疾病。
- 面临的挑战包括供体差异性和细胞密度选择。
结论
- 该人类临床前模型对研究骨转移具有重要价值。
- 它有助于深入理解癌细胞在骨微环境中的相互作用。
- 未来的研究可利用此模型拓展其在骨病理学中的广泛应用。
常见问题
行业重要性概述
这一完全人源的临床前模型通过在生理相关系统中重现癌细胞与破骨细胞之间的相互作用，实现了对骨转移中破骨细胞生成通路的机制性风险评估。该模型通过提供破骨细胞分化与功能的定量读数，支持抗肿瘤治疗药物的靶点验证和检测方法开发。通过在药物处理条件下直接观察两种细胞间的相互作用，并进行下游分析，该模型提高了先导化合物筛选的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究肿瘤诱导的破骨细胞生成相关治疗假设，并阐明骨微环境中的信号通路机制。
- 操作价值：通过在明确的共培养条件下模拟人原代单核细胞向破骨细胞的分化，支持生物学风险评估和功能靶点验证。
- 科学价值：通过量化癌症细胞刺激相对于生长因子对照所诱导的破骨细胞形成，有助于提升预测可信度并支持项目组合筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过使用RANKL和MCSF从PBMCs标准化诱导破骨细胞分化，制备可用于后续实验的经验证的生物体系。
- 操作价值：通过固定的细胞接种密度（7.5×10⁵ PBMC/cm²）和定时分化（14天），结合基于TRAP染色的破骨细胞定量，实现检测方法的标准化与可重复性。
- 科学价值：可在间接共培养（条件培养基）和直接共培养两种体系下检测药物对破骨细胞生成的影响，从而实现对化合物效应的可靠评估。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过改进破骨细胞生成实验，支持对骨质疏松症及其他骨骼疾病的相关性建模。
- 操作价值：采用完全来源于人类的细胞，降低从临床前研究向临床应用转化过程中的物种差异风险，确保转化连续性。
- 科学价值：通过测量破骨细胞数量和表面面积的变化，将其作为药物药效动力学生物标志物，从而支持基于风险评估的药物研发推进决策。
流程与工作流整合
该模型适用于从靶点验证到先导化合物发现，再到临床前药效学测试的整个发现流程，尤其适用于骨靶向治疗药物和骨微环境调节剂的研究。
- 发现生物学：支持对癌细胞来源因子在破骨细胞活化中的作用进行假设验证，并阐明RANKL非依赖性破骨细胞诱导机制的相关通路。
- 筛选：通过标准化的单核细胞分离、分化以及在通透性插入膜上与乳腺癌细胞系共培养，实现检测就绪，用于旁分泌和接触依赖性信号传导研究。
- 分析：提供定量的破骨细胞读数，包括TRAP染色、多核细胞计数和形态计量分析（表面积），以比较不同实验条件。
- 转化研究：通过使用临床相关乳腺癌细胞系研究药物对转移性骨微环境的影响，实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：可作为可重复使用的平台，用于研究多种癌症类型及乳腺癌以外的骨病理状态下破骨细胞的调控机制。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低破骨细胞与癌细胞相互作用中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的外周血单个核细胞（PBMC）分离、接种密度和细胞因子补充方案，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：通过在早期评估药物对破骨细胞形成和功能的影响，优化“推进/终止”决策，降低骨转移项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：通过量化化合物的促破骨细胞生成潜力，并基于对骨微环境调节作用的评估指导候选分子的推进，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备原代人源细胞分离、培养和分化技术的专业知识，包括外周血单个核细胞（PBMC）分离和单核细胞贴壁技术。
- 依赖于细胞计数、离心、显微镜观察（破骨细胞计数使用10倍物镜）以及细胞培养箱（37°C、5% CO₂）等仪器设备。
- 为减少实验变异，需在团队间统一外周血单个核细胞供体来源、细胞密度优化（7.5×10⁵ PBMC/cm²）以及共培养时间点（癌细胞接种后第11天）等关键参数。
- 若将该方法拓展至非乳腺癌细胞系或使用除RANKL/M-CSF以外的其他破骨细胞诱导刺激因子时，需进行相应的条件优化。
- 存在若干实际限制因素，例如不同供体间破骨细胞分化潜能的个体差异，以及外周血单个核细胞接种和共培养体系建立过程中对手动操作熟练度的要求。
