通过游离免疫荧光检测法靶向皮肤外周神经纤维中的α-突触核蛋白聚集体

帕金森病的诊断仍然依赖于疾病进展到后期才出现的运动功能障碍临床体征，此时黑质的大部分神经元已经丧失。本方案通过皮肤活检对皮肤神经进行分析，该方法可能成为一种新的疾病生物标志物，可用于临床试验。皮肤活检是一种易于实施、无创的操作，可获取易受病理影响的周围神经组织进行分析。

通过皮肤活检检测α-突触核蛋白聚集物可用于诊断目的，甚至可能在疾病早期阶段进行，此时潜在的治愈手段最为有效。对同一患者进行随访性皮肤活检，可实现对α-突触核蛋白聚集物在人体皮肤神经系统中时间与空间扩散过程的分析，从而有助于阐明疾病的发病机制。

开始此操作前，按照文本方案中表一的说明配制新鲜的PLP固定液。皮肤活检样本采集后，立即将其浸入含有10毫升固定液的离心管中，在4°C条件下孵育过夜。

第二天，在通风橱中轻轻去除PLP固定液。在同一管中，使用5毫升0.1摩尔的索伦森溶液，每次5分钟，洗涤活检组织三次。弃去索伦森溶液，加入5毫升冷冻保护液。

在4°C下孵育过夜。次日，若计划在一周内使用冷冻切片机进行切片，则将活检样本保存在4°C。首先，将冷冻切片机温度设置为-20°C。

取一个冷冻模具，加入冷冻包埋介质。用镊子将活检组织浸入冷冻包埋介质中，使其长轴与冷冻模具底部平行。用液氮快速冷冻样品，得到一个包含活检组织且方向正确的冷冻包埋介质固体块。

将样本放入冷冻切片机中，静置30分钟，使活检组织适应环境温度。随后将样本固定在冷冻切片机上，切成50 µm厚的切片。使用小刷子将冷冻切片转移至96孔板中，每孔预先加入200 µL防冻溶液。

此后，将该板置于零下20摄氏度保存。开始时，向一个新的96孔板的部分孔中加入100微升洗涤液。将待分析的样本从储存板转移至含有洗涤液的板中。

将切片在室温下置于洗涤液中孵育10分钟。然后将每张切片转移至含有相同洗涤液的空孔中，重复洗涤一次。接着向切片中加入洗涤液，并将其转移至含有100 µL封闭液的新孔中。

室温孵育至少90分钟，最多不超过4小时。用工作液稀释一抗PGP9.5和5G4。将切片转移至含有100 µL一抗工作液的新孔中，室温下孵育过夜。

第二天，按照之前所述方法，将切片在含有洗涤液的孔中进行洗涤。用工作液稀释二抗：山羊抗兔抗体用于检测PGP9.5，山羊抗小鼠抗体用于检测5G4。将洗涤后的切片转移至新的孔中，每孔加入100 µL含二抗的工作液。

用铝箔覆盖培养板，以避免荧光染料与二抗结合后发生漂白，并在室温下孵育90分钟。随后，按照前述方法用洗涤液将切片洗涤两次。将洗涤后的切片转移至新的孔中，加入100 µL DAPI，在室温下孵育5分钟。

按照前述方法，用洗涤液将切片洗涤两次。然后将切片正确放置在载玻片上，避免折叠错位。在载玻片上滴加数滴封片剂，并用盖玻片覆盖切片。

将载玻片在室温下过夜干燥。次日，将载玻片置于适当的盒子中，在4°C条件下避光保存。使用倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜观察切片。

通过连接到显微镜的相机获取图像。然后，按照文本方案中所述，使用荧光显微镜或共聚焦显微镜分析切片中的阳性信号，评估信号的空间分布和强度。根据所述方法，可在帕金森病（PD）患者支配自主结构的皮肤神经束中检测到经5G4抗体标记的α-突触核蛋白聚集物。

α-突触核蛋白沉积物的形态表现为皮肤神经轴突沿线的点状信号。该方案在19例帕金森病患者和17例对照者的三个解剖部位皮肤活检中的代表性应用显示，与健康对照组相比，5G4的敏感性为81%，特异性为86%。磷酸化α-突触核蛋白的敏感性为56%，特异性为100%。5G4阳性和磷酸化α-突触核蛋白阳性的沉积物主要出现在汗腺周围，但也可见于立毛肌、小血管以及表皮下和真皮神经丛，但从不出现于表皮内神经纤维中。

通常，在汗腺管腔内可观察到一种非特异性信号，该信号可能被误判为5G4或磷酸化α-突触核蛋白阳性。此类信号呈点状、球形，最可能源于管腔内的自发荧光物质，这一点已在未使用一抗和二抗的技术对照实验中得到证实。通过与标记神经纤维的PGP9.5进行共定位分析，有助于识别正确的信号，因为神经纤维在形态上呈丝状且细长，与上述非特异性信号明显不同。

因此，通过与轴突标记物进行双重免疫荧光染色，可显著提高5G4信号的特异性。准确固定活检组织对于获得高质量的免疫荧光染色结果以及可靠解读荧光信号至关重要。如果固定液配制不当或发生过度固定，将导致自发荧光增强，从而掩盖穿过真皮-表皮交界处或支配主要真皮结构的神经纤维信号。

该实验流程中最关键的步骤是组织固定。请注意PLP固定液的pH值以及孵育时间，以避免产生自发荧光和非特异性信号。