基于新型原子力显微镜生物筛选技术分离肌萎缩侧索硬化中TDP-43变异体形态特异性试剂

本实验的总体目标是利用两相基于原子力显微镜的放射状筛选技术，从噬菌体展示文库中分离出针对存在于LS中的43种变体的tar DNA结合蛋白的形态特异性试剂。该过程首先将一个多样化的噬菌体文库通过免疫管进行多轮针对非靶标抗原的负向筛选。

依次使用牛血清白蛋白、聚集态α-突触核蛋白和健康人脑组织进行阴性淘选。第二步是在每轮阴性淘选后完成荧光显微镜验证，以确保所有非目标噬菌体被成功去除。在此阴性淘选示例中，使用聚集态α-突触核蛋白时，一轮淘选后可见噬菌体，但在第10轮后噬菌体消失。

接下来，由于样本量有限，剩余的阴性淘选轮次将在 MICA 上进行。依次去除与健康组织以及额颞叶痴呆（FTD）组织中免疫沉淀的 TDP-43 发生反应的噬菌体。最后一步是分离出能够结合 ALS 免疫沉淀物的噬菌体。

使用结合云母的噬菌体展示TDP-43，通过胰蛋白酶、三乙胺和TG一细胞进行洗脱。最终，通过间接ELISA和点印迹法验证这些潜在的ALS克隆的特异性，将ALS-FTD均质化组织和健康人脑组织固定于两种检测体系中。通常检测到对ALS组织的反应性高于其他测试组。

与传统的噬菌体生物淘选技术相比，该方法的主要优势在于采用了经过荧光显微镜（FM）验证的彻底性阴性淘选流程，从而确保能够从复杂的生物样本中直接分离出选择性识别疾病特异性蛋白质变体的试剂，即使这些变体的浓度很低也能实现。尽管荧光显微镜（FM）可用于研究生物分子特征及其相互作用，但它也可应用于其他系统，例如监测生物淘选过程的进展，以及验证单个CLO的特异性。首先按照文本方案中详述的步骤进行噬菌体的制备，然后先对BSA进行阴性淘选，加入四毫升浓度为一毫克每毫升的溶液。

将牛血清白蛋白（BSA）溶液加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，分装至12个免疫管中，在4摄氏度下孵育过夜。接下来，合并来自三个文库的噬菌体颗粒，并保留少量该噬菌体混合物，用于后续验证阴性筛选过程。然后弃去第一管中的BSA溶液，用PBS洗涤2至3次以去除未结合的BSA，向第一管中加入合并后的噬菌体文库，在旋转仪上室温孵育30分钟，随后收集未结合的噬菌体。

请注意，在完成针对每个靶标的多轮负向筛选后，保留少量噬菌体非常重要，以便验证筛选过程的成功，并在发生污染时，每次使用剩余的BSA溶液管重复进行负向筛选。使用上一管孵育后收集的未结合噬菌体。然后采用视频下一节中详述的A FM方法，验证所有BSA噬菌体结合物是否已被完全去除。

为了使用荧光显微镜（FM）观察噬菌体结合情况，将10至20微升的目标抗原加入到裂解的云母片上，孵育5至10分钟。用纯水洗涤云母片5次，然后加入10至20微升的噬菌体溶液至云母片上，继续孵育5至10分钟。再次用纯水洗涤云母片5次，随后使其自然风干。

在室温空气中，使用纳米扫描仪三型控制器，以轻敲模式执行原子力显微成像。所用硅基原子力显微镜探针的共振频率为 300 千赫兹，弹性常数为 40 牛顿每米。将原子力显微镜针尖插入针尖装载器中。

将探头加载器连接到原子力显微镜（AFM）上。将样品置于原子力显微镜（AFM）下。使用旋钮调节激光，使其对准原子力显微镜（AFM）探头。

将扫描速率设置为 3.05 赫兹，扫描分辨率为每行 512 个采样点。自动调谐仪器以优化二氧化硅振动。启动探针频率，开始样品扫描。

探针将扫描MICA表面，测量结合的噬菌体的高度。噬菌体在图像中呈现为长的白色条带，在获取图像后，通过对背景进行基本的平整化处理，以确保每幅图像内的所有颗粒大小具有可比性。由于其他颗粒的大小和扫描区域的不同，噬菌体的宽度可能在不同图像间有所变化，但这不会影响判断噬菌体是否与抗原结合的准确性。

将图像展平为二维图像，并标出因聚乙二醇（PEG）污染导致成像质量较差的区域，以便在后续数据分析中予以剔除。根据文本方案所述，从健康人脑组织中免疫沉淀出足量的健康TDP-43蛋白，但由于免疫沉淀蛋白量较低，需注意操作。首先使用MICA进行多轮阴性筛选：将八个MICA表面与第一个MICA结合，加入约100 µL免疫沉淀蛋白，室温孵育5至10分钟。孵育结束后继续后续操作。

用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液（简称PBST）洗涤MICA五次。然后在对健康人脑组织进行阴性淘选后，向其中加入约100微升噬菌体，并在室温下孵育5至10分钟。在孵育进行到一半时，将免疫沉淀的蛋白质加入第二块MICA。

在用0.1% PBST洗涤MICA五次之前，先收集第一次的噬菌体。洗涤第二块云母片后，加入先前收集的噬菌体。重复整个过程，直至噬菌体针对所有八块含有免疫沉淀蛋白的云母片完成负向筛选。

使用噬菌体在第一轮和第八轮阴性淘选后，通过FM验证淘选过程的成功，随后开始从肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者脑组织中免疫沉淀TDP-43蛋白，具体步骤如文本方案所述，裂解三块MICA表面。然后在室温孵育5分钟后，向第一块MICA加入50微升ALS TDP-43。用0.1% PBST洗涤MICA五次。

接下来，将阴性筛选健康TDP 43后收集的50微升噬菌体加入MICA中，孵育5分钟。收集未结合的噬菌体。在这些筛选步骤中，必须将所有收集的噬菌体分别保存。

接下来，使用三种洗脱方法收集结合的噬菌体。首先，向每个MICA中加入50微升胰蛋白酶，孵育时间不超过10分钟。收集溶液并保存。

接下来，向每个MICA中加入50 µL的100 mM三乙胺，孵育时间不超过10分钟。用等体积的1 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）收集溶液。第三步，直接向MICA中加入50 µL TG1细胞，于37°C孵育30分钟。同时，将前两种洗脱方法收集的噬菌体以相同浓度加入100 µL TG1细胞中，于37°C孵育30分钟。

接下来，用第二片MICA重复此过程。将使用第一片带有A-L-S-T-D-P 43的MICA收集到的未结合噬菌体加入到第二片带有A-A-L-S-T-D-P 43的MICA中，孵育5分钟。将经噬菌体感染并从每片A-L-S-T-D-P 43 MICA中用胰蛋白酶消化释放的TG1细胞混合，接种至含氨苄青霉素的LB琼脂平板（LBA平板）上。

对两组 A LS TDP 43 MICA 中的三乙胺和 TG one 全长噬菌体重复上述过程，共制备三块平板。使用第三块 A LS 云母片重复所有步骤，但在本情况下，使用经过两轮针对额颞叶痴呆负向筛选后收集的噬菌体。将感染的 TG one 细胞接种至三块 LBA 平板上，并在 37 摄氏度下过夜培养。

第二天，对六块LBA平板上可能的a LS克隆进行菌落数量计数。与经过两轮针对健康TDP 43进行阴性筛选后，再利用噬菌体进行两轮阳性筛选所获得的三块LBA平板相比，来自第三次A LS MICA的三块LBA平板上的菌落数量应更少。从这些克隆中产生噬菌体及可溶性单链可变区抗体片段（s cvs），并使用不同的免疫检测方法分析，以验证其对a LS组织的特异性。

采用FM成像技术监测针对不同靶标的阴性淘选步骤，以确保去除所有具有反应性的噬菌体。FM结果显示，在针对聚集态α-突触核蛋白进行一轮阴性淘选后仍有噬菌体结合，而在八轮淘选后则无结合信号。通过针对健康人脑组织进行阴性淘选，以去除可结合健康人脑匀浆中多种抗原的噬菌体。

图中显示，经过一轮负向筛选后，噬菌体仍可结合健康组织，而经过十轮负向筛选后，已无噬菌体残留结合。在制备出潜在克隆的噬菌体和可溶性SCFE后，通过间接ELISA检测其对LS组织的特异性。几乎所有噬菌体均表现出对LS组织的偏好性，而非健康组织。

在比较噬菌体与额颞叶痴呆（FTD）组织中a LS的结合时，也获得了类似的结果。SCFV在健康组织和FTD组织中的a LS组织结合比较再次显示，几乎所有克隆均对a LS组织具有选择性结合。采用点印迹免疫测定法进一步验证了对a LS组织的结合能力，同时也确定了哪些克隆在其他免疫学应用中具有反应性。

此处展示了一个结合物与LS组织的结合。观看本视频后，您应能充分理解如何应用基于FM的生物淘选技术，以分离针对疾病特异性感兴趣靶标的试剂，这些试剂可能作为潜在的诊断和/或治疗工具。