由突变黑色素细胞干细胞启动小鼠黑色素瘤的空间与时间控制

黑色素瘤在全球范围内被广泛诊断，其发病率呈上升趋势。这些实验方案能够精确控制黑色素瘤发生的早期阶段，有助于研究其发育过程。通过调控黑素细胞干细胞激活的时间和位置，我们能够明确干细胞群体内部的变化及其向黑色素瘤新发转化的过程。

演示该实验操作的是来自实验室的研究生 Dahihm Kim 和 Luye An。在开始实验前两到三天，使用电动剃毛器对每只七周龄的麻醉小鼠背部皮肤进行剃毛。实验当天，用棉签将一层薄薄的脱毛膏涂抹于暴露的皮肤上。

待乳膏均匀涂抹后，使用干净的棉签擦除乳膏，再用湿润的布轻轻擦拭以去除残留的乳膏。随后将每只小鼠放回其饲养笼中，并持续监测直至完全恢复。对于UV-B照射，需用UV-B防护材料覆盖小鼠背部皮肤，仅暴露目标区域，同时用抗UV的盖子覆盖UV照射室。

然后打开UV-B灯，对小鼠照射适当的实验时间，之后将小鼠放回空笼中进行监测，直至完全恢复。为分离皮肤样本，使用电动剃毛器去除经安乐死处理的照射小鼠背部皮肤区域的毛发，并用无绒布轻轻擦拭暴露的皮肤以清洁该区域。用锋利的剪刀在尾部基部稍上方做一个小切口，将大型钝头剪刀插入切口，分离皮下结缔组织。

使用锋利的剪刀，小心地沿目标皮肤区域边缘剪下，以分离组织样本，并将切除的皮肤组织放置在一张干净的纸巾上。然后用钝头镊子拉伸皮肤，使其紧贴纸巾并保持绷紧。当所有样本采集完毕后，立即将皮肤样本连同其下方的纸巾衬垫一起放入折叠滤纸中，紧邻折痕处放置，注意确保样本平整，无折叠或褶皱。

用订书钉封闭滤纸的两侧，并修剪滤纸。然后将样品完全浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定3至5小时，随后用去离子水进行两次、每次五分钟的洗涤。第二次洗涤后，仔细去除皮肤组织上残留的物质，并修剪样品边缘，使其光滑整齐。

接下来，在每个样本上做三个矢状切口，使条带的宽度不超过5毫米，并做横向切口，使样本的宽度不超过20毫米。将含有最佳切割温度介质（OCT）的冷冻模具竖直放置，然后将4至5块皮肤组织置于OCT上。当所有组织块就位后，使用两把精细镊子将每块皮肤的长边拉至冷冻模具底部，使样本在OCT中保持垂直，并与模具底部垂直。

然后用额外的OCT填充模具至第二层边缘，并将模具放置在干冰的平坦表面上，使用镊子在冻块开始冻结时根据需要调整在转移过程中可能发生移位的皮肤组织。当小鼠出生后七周时，其背部皮肤处于休止期（telogen）。在休止期期间，毛囊和黑素细胞干细胞已知处于静止状态，剃毛后皮肤应无明显毛发生长。

然而，化学脱毛可诱导毛囊干细胞活化，导致目标区域出现显著的毛发生长。由于化学脱毛能显著激活毛囊干细胞和黑素细胞干细胞，处于活化状态的易发黑色素瘤的黑素细胞干细胞可形成肿瘤，且在化学脱毛后两周内即可观察到微观的黑色素瘤启动现象。UV-B 照射也可诱导静息状态的、易发肿瘤的黑素细胞干细胞启动肿瘤形成。

重要的是，UV-B 可诱导黑素细胞干细胞从其毛囊干细胞生态位直接迁移至表皮间区。此外，UV-B 可在整个表皮间区诱导起源于黑素细胞干细胞的皮肤黑色素瘤形成。与背部皮肤类似，UV-B 诱导的黑色素瘤发生亦可在其他皮肤区域（如耳部皮肤）中显著观察到。

事实上，与覆盖有防紫外线布料的对照组耳部皮肤相比，暴露于UV-B下的耳部皮肤由于黑素瘤启动负担更高而表现出更强的色素沉着。不同的UV-B剂量可能对小鼠皮肤及黑素细胞活性产生不同的影响。因此，在开始实验之前，确定并优化照射剂量至关重要。