小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-C（UV-C）损伤所致氧化损伤的评估

大家好，我是Bipasha Bose博士。我在印度芒加罗的Yenepoya大学Yenepoya研究中心干细胞与再生医学中心担任副教授兼负责人。接下来，我们将演示如何检测经不同剂量紫外-C辐射处理后的小鼠眼表活体培养物中活性氧（ROS）的存在。

该技术的优势在于，可同时检测活性氧物质以及活细胞和死细胞的存在，而无需使用Vester细胞。该技术的原理主要基于染料DCFDA对活细胞的通透性。DCFDA是一种可穿透活细胞的无色染料，在发生氧化应激时，会被细胞内的氧化酶作用，转化为发出绿色荧光的DCF。

因此，绿色荧光使我们能够检测活细胞中活性氧的存在。另一方面，碘化丙啶是一种仅能穿透死细胞的染料，可发出红色荧光，它是一种作用于双链rDNA的嵌入性染料。

然而，Hoechst 染料可穿透活细胞和死细胞，是一种蓝色细胞核染色剂。因此，这是一种非常简单的方法，可随着时间推移检测长期培养物中活性氧的存在情况，同时评估死细胞数量。

每35毫米培养皿接种两百万个细胞。所使用的细胞为小鼠眼表来源的细胞。从每块细胞培养皿中尽可能吸除培养基液体。

在细胞附近保留约 500 微升的细胞培养基。少量培养基可防止细胞干燥。然而，保留少量培养基的主要目的是使 UVC 照射达到最大穿透效果。

将细胞置于紫外光源下，可以使用紫外交联仪，也可以使用其他任何紫外-C（UVC）光源。使细胞暴露于不同剂量的UVC辐射，例如每平方米1、10、100、1,000和10,000焦耳。当细胞暴露于紫外-C辐射时，培养皿盖应处于打开状态。

这将使短波紫外线最大程度地穿透到细胞中，从而显示细胞对短波紫外线辐射的最佳剂量-反应关系。将细胞移至超净工作台，并为每个培养皿补充两毫升完全培养基。该完全培养基含有20%胎牛血清的DMEM，添加物包括1%最低必需非必需氨基酸以及1%抗生素（青霉素和链霉素）。

随后，补充最大体积的完全培养基，即两毫升，将培养板放回培养箱中，在紫外-C辐射后孵育三小时，以观察其早期效应。在UVC照射后细胞孵育的最后15分钟内，准备活细胞染色液。染色液使用含有10%FBS的DMEM配制，并预先加热至37摄氏度。

配制 10 毫升染色液时，首先从 10 毫摩尔的储备液中加入 5 微升 DCFDA，以获得 5 微摩尔的终浓度。通过上下吹打充分混匀。其次，从 10 毫克/毫升的储备液中加入 5 微升 Hoechst 溶液，以获得 5 微克/毫升的终浓度。

用移液器上下吹打充分混匀。最后，从浓度为1毫克/毫升的储备液中加入200微升碘化丙啶，使终浓度为20微克/毫升。再次用移液器上下吹打充分混匀。

现在染色液已准备好可供使用。在UVC照射后孵育三小时，将培养板从CO2培养箱中取出。吸去已暴露于不同剂量UVC（如每平方米1、10、100、1,000和10,000焦耳）的各培养皿中的培养基。

现在，从培养皿的侧边轻轻向每个培养皿中加入 2 毫升新配制的活细胞染色液。将培养皿重新放回 CO2 培养箱中，孵育 15 分钟以进行活细胞染色。在活细胞染色液中孵育 15 分钟后，移除含有经不同剂量紫外线-C 辐射处理细胞的各培养皿中的染色液。

向细胞中加入两毫升完全培养基。此时细胞已准备好用于观察。现在将对照细胞置于荧光成像仪的明场下。

这些细胞看起来明显正常，因为它们是对照细胞。在蓝光视野下，我们可以看到荧光标记的全部细胞；在绿光视野下，则显示活性氧（ROS）的产生。

由于这些是对照细胞，因此没有活性氧产生。在红光视野下，可见经碘化丙啶染色的死亡细胞。随后在明场下，将经紫外线照射（100 焦耳/平方米）的样本继续培养。

在蓝光视野下，我们还可以看到蓝光视野下的总细胞数量。然而，当我们切换到绿光视野时，可观察到DCFDA阳性的细胞，同时也能看到PI阳性的死亡细胞。最后，将接受最大紫外线剂量（即10,000焦耳/平方米）照射的细胞置于明场下观察。

我们可以观察到细胞形态异常。然而，在蓝光视野下可见全部为蓝色的细胞。在绿光视野下，可见发出绿色荧光的DCFDA阳性细胞，表明有活性氧（ROS）的产生。

当细胞暴露于红色视野时，所有细胞均发出红色荧光，表明在以 10,000 焦耳每平方米的紫外线剂量处理后，细胞死亡数量显著增加。现在将不同通道拍摄的图像按组排列，整合为单个复合图像面板，对应不同的紫外-C 剂量组及未暴露的对照组。图像以分组形式排列在同一个面板中。

首先，明场图像；其次，Hoechst 蓝色核染色；第三，碘化丙啶染色，用于标记死亡细胞核。

第四，DCFDA用于检测ROS阳性细胞；第五，合并图像。当我们观察第一行和第二行图像时，即未暴露的对照组以及暴露于1焦耳/平方米UVC剂量的细胞，我们发现无论是PI染色还是ROS阳性细胞均未出现荧光信号，这表明在未暴露的对照组以及如此低剂量的1焦耳/平方米UVC照射下，细胞内完全不存在活性氧（ROS）生成和细胞死亡现象。

接下来观察暴露于100焦耳每平方米剂量下的细胞复合图像第三行。在此剂量下，仅有极低比例的细胞（约10%）同时对PI和DCFDA呈阳性，表明活性氧（ROS）生成量和细胞死亡均处于较低水平。接下来，我们继续观察更高剂量的UVC辐射暴露，即复合图像第四行所示的1,000焦耳每平方米。

在此，约 70% 的细胞对 PI 和 DCFDA 呈阳性。最后，我们进入最高剂量的 UVC 照射，即每平方米 10,000 焦耳，如组合图像第五行所示。在此条件下，几乎所有细胞对 PI 和 DCFDA 均呈阳性，表明在此特定 UVC 剂量下细胞死亡率达到 100%，同时活性氧（ROS）生成也达到 100%。

将图像导入成像软件中。首先打开显示Hoescht染色细胞核的蓝色图像，该图像代表细胞总数。打开计数工具，依次单击每个细胞，以获得细胞数量。

现在打开在红色通道下拍摄的图像，该图像显示 PI 染色阳性的死亡细胞。打开计数工具，依次点击每个红色斑点，以记录 PI 染色阳性死亡细胞的数量。完成死亡细胞计数后，切换至绿色通道下拍摄的细胞图像，打开计数工具，依次点击每个绿色斑点，以标记显示活性氧（ROS）生成的细胞。

完成在绿色通道下捕获的绿色细胞计数后，利用公式计算UVC损伤导致的细胞死亡百分比以及UVC损伤引起的活性氧（ROS）产生百分比。细胞死亡百分比的计算公式为：碘化丙啶（PI）阳性细胞（即发红色荧光的细胞）数量除以Hoechst阳性细胞数量，再乘以100。UVC损伤引起的ROS产生百分比的计算公式为：DCFDA阳性（即发绿色荧光）细胞数量除以Hoechst阳性细胞数量，再乘以100。

获得细胞死亡百分比和活性氧（ROS）生成百分比后，使用这些数值绘制柱状图。X 轴表示紫外线（UV）剂量，Y 轴表示细胞百分比。绿色柱代表活性氧生成百分比，红色柱代表细胞死亡百分比。

分析结果显示，在100焦耳的UVC剂量下，有10%的细胞产生活性氧（ROS），同时出现10%的细胞死亡。而在10³焦耳/平方米的UVC剂量下，70%的细胞表现出活性氧生成及细胞死亡。当UVC剂量达到最高水平，即10⁴焦耳/平方米时，几乎所有细胞（约100%）均出现细胞死亡以及活性氧的产生。

因此，可以得出结论：活性氧的生成与细胞死亡之间存在强烈的正相关关系。总之，该技术非常适用于在活体正常细胞培养中同时评估活性氧、活细胞和死细胞。该技术也可用于长期培养中活性氧、活细胞和死细胞的有限评估，例如暴露于紫外线辐射或化学试剂等各种细胞损伤因子的情况。

该技术还可指导研究人员确定收获细胞的最佳时间，例如在50%ROS、75%ROS等条件下，以便用于多种后续实验，如qRT-PCR和蛋白质印迹（Western blotting）。