使用多重共免疫沉淀法量化蛋白质相互作用网络动态

定量多重共免疫沉淀（QMI）技术使研究人员能够在预定义的蛋白质相互作用网络中同时测量数百种二元相互作用。通过在同一体系裂解液中同时进行多次共免疫沉淀实验，再结合生物信息学方法，即可分析多组蛋白质共关联变化的协调模式。该检测方法在开发阶段耗时较长，但一旦构建完成QMI检测面板，便可在相对简单的过夜实验中获取网络规模的信号转导系统数据。

QMI 需要将不同的样品和试剂准确地移液至 96 孔板中。在建立和运行每个检测时，应仔细记录以防止错误。进行样品制备和免疫沉淀时，首先在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的合适去垢剂中裂解样品，并在冰上孵育 15 分钟。

孵育结束后，离心样品以去除膜成分和碎片，然后对上清液进行BCA蛋白定量检测，按照标准操作流程测定蛋白浓度。在将蛋白浓度归一化后，配制磁珠主混合液，每孔含各类磁珠约250个。使用磁力分离法用Fly P缓冲液洗涤磁珠混合物两次，随后将磁珠重悬于每份样品20 µL的Fly P缓冲液中。

充分吹打混匀后，将20微升珠子分装至每个样品对应的预冷微量离心管中，并向每管加入等体积、经蛋白浓度归一化的裂解液，用于免疫沉淀。随后，将每份裂解液样品分至每个实验所用的平板对应的管中，并在4°C、避光条件下于旋转仪上孵育过夜。次日早晨，使用磁力架从第一组管中移除裂解液，并用500微升预冷的Fly P缓冲液洗涤珠子两次，每次洗涤均使用500微升。

计算重悬体积后，将免疫沉淀物重悬于相应体积的冰上预冷的 Fly P 缓冲液中。通过轻柔吹打充分重悬磁珠，并将 25 微升磁珠悬液分装至冰上的平底 96 孔板中，每孔 25 微升。在另一个 96 孔板中，将稀释后的探针抗体稀释至两倍工作浓度。

使用多通道移液器将每种探针抗体稀释液各25微升加入含有磁珠的检测板的相应孔中，并在水平板式振荡器上高速振荡以混匀并重悬磁珠。混匀后，降低振荡速度，在4°C避光条件下孵育1小时。孵育结束后，在4°C条件下，使用磁板洗涤仪每次加入新鲜的Fly P缓冲液洗涤3次。

最后一次洗涤后，将磁珠重悬于50微升Fly P缓冲液中，其中加入链霉亲和素-PE（按1:200稀释）。混匀后轻轻振荡，使磁珠充分重悬，然后将酶标板置于4°C避光孵育30分钟。孵育结束后，在4°C条件下使用磁性板洗涤仪用Fly P缓冲液洗涤3次，并将磁珠重悬于125微升Fly P缓冲液中。

以每分钟900转的速度振荡平板1分钟，充分重悬磁珠，然后将平板载入带制冷功能的流式细胞仪。在流式细胞仪软件中，选择“High RP1 Target”设置，停止条件为每个区域1,000个微球，上样体积为80微升。运行至一半时暂停，重新混悬微球以防止沉降。

运行结束后，将数据文件导出为 XML 格式。为了进行 ANC 分析，需填写 ANC 输入文件，以反映实验设计的详细信息，然后运行程序，程序会将一个 CSV 文件写入当前活动目录中。该文件以 hits 结尾。

csv 将报告在对照组和实验组之间，在四次实验重复中至少有三次出现显著差异（假阳性水平为 0.05）的蛋白质共关联结果。对于加权相关网络分析，将 Matlab 输出的数据文件中以 mfi.csv 结尾的列标题复制到新电子表格的第一列，并添加“Experiment”列用于表示实验编号，“Treatment”列用于表示实验处理，以及其他需要分析的变量列。

将此文件保存为 traits.csv 并打开 R Studio。将工作目录设置为包含 mfi 的文件夹。

csv 和 traits.csv 文件，选中代码的相应部分，然后按 Command+Enter 运行注释中指示的 R 命令。与各实验性状显著相关的加权相关网络分析模块将以图形文件形式输出，每个相互作用与各模块的相关性将以 CSV 文件形式输出。

对于 ANC 输出文件中的每个相互作用，判断该相互作用在 CNA 中是否也具有显著性，并创建一个新列，用于指示每个 ANC 显著结果是否同时也是 CNA 显著结果。将数值转换为 log2 倍数变化值，并计算所有 ANC 与 CNA 共有显著结果的平均值。最后，创建一个新的电子表格，其中每一行列出 ANC 与 CNA 共有的显著结果，第一列为免疫沉淀靶标，第二列为探针靶标，第三列为倍数变化值。

将此文件作为网络导入 Cytoscape，以生成节点-边关系图。通过两种独立的统计方法鉴定出的高置信度蛋白质相互作用，可使用开源软件 Cytoscape 可视化为节点-边关系图，或使用补充材料中提供的 R 代码及分析说明生成热图。在整个实验流程中，操作人员需注意准确移液、详细记录实验过程，并始终确保样品保持低温。

我们已利用量子磁感应（QMI）来理解信号转导通路如何区分不同类型的输入，并整合来自多个受体的信息。