通过免疫共沉淀法在核组分和胞质组分中可视化蛋白质-蛋白质相互作用 原位 邻近连接实验

本实验的总体目标是比较免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，简称 co-IP）和邻近连接实验（proximity ligation assay，简称 PLA）在可视化细胞不同区室中蛋白质-蛋白质相互作用方面的优缺点。本文所展示的两种不同方法的比较，可帮助科研人员在研究蛋白质-蛋白质相互作用于细胞核与细胞质中的分布模式时，选择更适用于其特定研究目的的方法。co-IP 的主要优势在于能够检测真实的蛋白质-蛋白质相互作用。

相比之下，pla 的优势在于能够在单细胞水平上快速分析细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。按照文本所述方案培养并收集 Hex293 细胞后，向 3 × 10⁶ 个细胞中加入 300 µL 冷的胞质提取液，以最高速度涡旋振荡 15 秒。将提取物置于冰上孵育 30 分钟，孵育期间每 10 分钟涡旋振荡样品 5 秒。

然后加入16.5 µL冷的胞质提取液，涡旋振荡5秒，将样品置于冰上孵育5分钟。再次涡旋提取物5秒，于4 °C、16,000 × g 离心5分钟。将上清液转移至新的预冷离心管中，置于冰上保存备用。随后用1 mL冷的PBS通过反复吹打清洗不溶性沉淀物3次，每次清洗后吸除PBS。

接下来，加入150 µL冷的核提取液，涡旋振荡15秒，于冰上孵育1小时。孵育期间每10分钟涡旋振荡样品15秒，并用200 µL枪头将溶液吹打10次。再次涡旋振荡管子15秒，然后在4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟，将含有核提取物的上清液转移至新的预冷离心管中，置于冰上保存待用。

分别取核提取物和胞质提取物总体积的10%作为输入样品，然后向剩余提取物中加入冷PBS，调整终体积至1毫升。置于冰上保存，待用。如需预先清除蛋白G偶联磁珠，将40微升蛋白G偶联磁珠与4微克快速多克隆抗RBM3抗体，或快速IgG（作为阴性对照）在200微升PBST中混合。

在旋转仪上孵育至室温，持续40分钟。将离心管置于磁力架上，然后移除并弃去上清液。随后用200微升PBST洗涤磁珠一次。

将一毫升稀释后的裂解液加入珠子中，在4°C条件下于旋转仪上孵育过夜。次日，将离心管置于磁力架上，吸去上清液。向珠子中加入0.5毫升PBST，在4°C条件下以20 rpm的固定转速于旋转仪上洗涤三次，每次10分钟。

通过加入40微升上样缓冲液从磁珠中洗脱蛋白，然后将样品在70摄氏度加热10分钟。离心沉淀磁珠后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。进行免疫细胞化学实验时，在八孔多聚赖氨酸包被的载玻片中，以每孔1.5 × 10⁴个细胞的密度接种HEK293细胞。

在含有10%胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的0.4毫升DMEM培养基中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞48小时，然后吸去培养基，使用4%多聚甲醛在室温下于超净台中固定细胞10分钟。随后吸去多聚甲醛，每孔使用0.5毫升PBS洗涤细胞三次。

加入含0.5% Triton X-100和5% NGS的PBS溶液，以透化并封闭细胞，室温孵育1小时。随后，将抗NF90单克隆抗体和抗RBM3多克隆一抗按1:100稀释，加入各孔中，4°C摇床孵育过夜。次日，用0.5毫升PBS洗涤腔室，每次10分钟，共洗涤三次。

进行免疫细胞化学染色时，向细胞中加入1:500稀释的绿色荧光染料标记的抗小鼠抗体和红色荧光染料标记的抗兔抗体，室温孵育一小时。加入1:5,000稀释的DAPHE NBPS对细胞核进行复染，室温孵育10分钟，然后用PBS如前所述洗涤样本。从载玻片上取下腔室并将其干燥，每张载玻片使用250 µL封片液进行封片。

为了制备邻近连接探针，细胞与一抗孵育并按前述方法洗涤后，将预先制备好的探针用含0.1% Triton X-100和5% NGS的PBS溶液稀释至1:5，每张八孔玻片使用总体积为320 µL。室温孵育20分钟。从玻片上取下腔室，加入稀释后的探针，然后将腔室置于37°C的湿化孵育箱中孵育1小时。

通过混合8 µL连接酶、64 µL 5x连接反应缓冲液和248 µL水来配制连接反应液。轻敲载玻片以去除液体，使用Onex Wash Buffer A对样品进行两次清洗，每次5分钟。将连接反应液加入样品中，并在37°C的湿润培养箱中孵育30分钟。

通过混合4 µL聚合酶、64 µL 5x扩增原液和252 µL水来配制扩增溶液，并用铝箔包裹管子以避光。然后，轻敲载玻片以去除液体，使用1×洗涤缓冲液A将样本洗涤两次，每次两分钟。将扩增溶液加入样本中，在37°C的避光湿盒孵育器中孵育100分钟。

然后，像之前一样吸去液体，用洗涤缓冲液B洗涤样品两次，每次10分钟，再用0.1×洗涤缓冲液B洗涤一次。最后，将载玻片干燥，并用250 µL含DAPHE的商用封片液封片，在显微镜下观察荧光，并用CCD相机采集图像。以RBM3为诱饵蛋白的共免疫沉淀实验显示，NF90与RBM3的相互作用主要存在于细胞核中，少数存在于细胞质中。在此免疫荧光实验中，NF90和RBM3均可见于细胞核内。

在C2细胞中，这两种蛋白也均存在于细胞质中，并且在每个区室中均表现出完全的共定位。从这些图像可以看出，邻近连接实验揭示了NF90与RBM3相互作用的分布模式，该模式与传统的免疫细胞化学结果非常相似，即在大多数细胞中，相互作用主要发生在细胞核内。仅有少数细胞显示出NF90-RBM3相互作用主要分布在细胞质中。

在进行该实验操作时，需要牢记的是，尽管 PLA 方法更为便捷，但它并不能直接反映蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而共免疫沉淀（co-IP）则能够检测到定向的相互作用。此外，一抗的特异性决定了实验结果的质量。

观看本视频后，您应能够充分理解如何根据自身的实验目的，选择适当的方法来研究不同细胞区室中的蛋白质-蛋白质相互作用。