利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

基因功能和疾病的研究因人类群体的远交特性而受到阻碍。患者特异性诱导多能干细胞系与对照细胞系之间不同的遗传背景可能影响特定功能检测中的分化效率和表型结果。使用遗传背景完全相同或同源的细胞系，其中唯一的差异是目标突变，对于克服这些问题至关重要。

许多人类疾病由杂合突变引起，而使用 CRISPR-Cas9 系统难以高效构建此类突变。这主要是因为非靶向等位基因上可能产生插入或缺失（indel）突变，且发生频率很高。我们的技术通过使用两个修复模板来克服这一问题，其中仅有一个模板携带目标突变。

任何尝试该技术的研究人员均应熟练掌握人类多能干细胞培养技术。菌落挑取的视频演示将有助于展示正确的大小、形态以及挑取和筛选所用的技术。本操作程序由 Leo Cardenas 进行示范。

首先，将人胚胎干细胞接种于经照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，置于6孔板中。制备转染主混合液，用移液器轻轻混匀，室温孵育15分钟。

当细胞达到70%至80%融合度时，将转染主混合液逐滴加入含细胞的每个孔中，在37摄氏度下孵育48小时。每24小时更换一次培养基。收集细胞时，首先在室温下用Triple E孵育细胞3分钟，以酶解方式去除MEF细胞。

加入0.5毫升含10微摩尔ROCK抑制剂的hESC培养基。在300 × g离心3分钟以收集细胞，并重悬于0.5毫升含10微摩尔ROCK抑制剂的人胚胎干细胞（hESC）培养基中。将细胞悬液通过35微米细胞滤网帽过滤至5毫升离心管中。

采用荧光激活细胞分选技术，对活细胞设门并分选绿色荧光蛋白阳性细胞。随后，将最多1.5 × 10⁴个分选后的细胞直接接种至经1–3倍基底膜基质包被并含有经辐照的MEF细胞的10厘米培养皿中，培养基为含ROCK抑制剂的人胚胎干细胞培养基。之后每日更换不含ROCK抑制剂的人胚胎干细胞培养基。

培养10至15天后，菌落直径约为1至2毫米。在显微镜下，使用P200移液器小心刮取单个克隆，并将细胞吸入移液器中。用移液器吸取含有菌落的培养基，轻轻吹打3至4次，将细胞分散至96孔板的一个孔中。

然后，针对每种向导RNA挑选20个菌落，分装到PCR条状管中进行筛选。在10,000 × g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。接着，将细胞沉淀加入20 µL蛋白酶K缓冲液中孵育，以分离DNA，并剧烈涡旋振荡。

在10,000 × g条件下离心5分钟。随后对编辑后的DNA进行PCR筛选。向各管中加入20微升的预混液（包含用于扩增目标区域的正向和反向引物）以及5微升蛋白酶K消化液。

进行筛选性PCR时，使用来自对照iPSC细胞系的基因组DNA以确认获得清晰的扩增产物。在2.5%（质量体积比）琼脂糖凝胶中以70至90伏电压电泳1小时后，评估PCR产物的大小变化。任何大小差异均提示存在切割现象。

为了转染单链寡核苷酸DNA和CRISPR-Cas9质粒，将目标细胞系接种于6孔板中的辐照MEFs上，经一夜培养后使其融合度达到70%至80%。按所述方法设置转染反应，用移液器轻轻混匀反应液，在室温下孵育15分钟。

然后，将转染反应混合物逐滴加入细胞中。48小时后，按照之前的方法制备细胞用于细胞分选。接种单细胞约10天后，使用200微升移液器将克隆挑取至PCR条状管中，并转移至预先用明胶和MEFs包被的12孔板的一个孔中。

将100微升细胞转移至已包被明胶并接种了经照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的24孔或48孔板的每个孔中，培养基为含ROCK抑制剂的人胚胎干细胞培养基。剩余的100微升细胞用于DNA提取。为检测单链寡核苷酸DNA是否成功整合，从每个克隆提取的DNA中取5微升，使用先前设计的筛选引物进行PCR扩增。

纯化PCR产物，并利用单链寡核苷酸DNA中创建的特异性酶切位点，配制40微升的限制性内切酶消化反应体系。通过移液混匀反应液，在制造商推荐的温度下孵育1至3小时。随后，将加入上样染料的酶切PCR产物在含1.5%（质量/体积）溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，在80至100伏电压下电泳40分钟，以观察结果。

如果单链寡核苷酸DNA成功整合，则使用巢式引物进行序列特异性突变分析。在本研究中，为构建向导RNA，从1.5%琼脂糖凝胶中切下一条100 bp的条带。细胞转染后，通过2.5%琼脂糖凝胶电泳观察向导RNA切割效果的验证结果。

180个碱基对的PCR产物显示了未切割的对照组以及不同克隆中因插入或缺失（indel）形成而导致的条带迁移现象。不同的向导RNA具有不同的切割效率。为了防止CRISPR-Cas9对已编辑等位基因的再次切割，利用G到A的同义突变对PAM序列进行了修饰。

PAM序列中的一个同义突变产生了一个独特的限制性酶切位点，有助于筛选成功整合到一个或两个等位基因中的情况。经过基因组编辑的干细胞系可用于后续的分化实验和功能检测，以研究特定突变对人类发育和疾病的影响。该方法能够生成携带特定杂合或纯合突变的同源细胞系，这些突变与多种人类疾病相关。

这些疾病模型为开发新的细胞疗法铺平了道路，同时也为药物发现提供了平台。